Seznam anotací:

1. Analýza vazebných vlastností nádorového supresoru proteinu p53(BFÚ)
2. Uspořádání genů, chromosomů a genomu v interfázním jádře zdravých a nádorových buněk a jeho vztah ke genové expresi (BFÚ)
3. Struktura a evoluce pohlavních chromosomů modelového dvoudomého druhu Silene latifolia (BFÚ)
4. Nová rodina růstových faktorů pro adenosin deaminázu (ENTÚ)
5. Umlčení genu in vivo pomocí RNAi interference zprostředkované virem Sindbis (ENTÚ)
6. Změny v rozšíření denních motýlů a oteplování klimatu (ENTÚ)
7. Esterifikační rychlost cholesterolu a poměr plasmatických triglyceridů a cholesterolu: významný diagnostický ukazatel (FGÚ)
8. Protektivní úloha UCP2 při stárnutí buněk: vliv na tvorbu kyslíkových radikálů v mitochondriích (FGÚ)
9. Charakterizace mechanismu účinku funkčně specifického dlouhodobě působícího M1 muskarinového agonisty xanomelinu (FGÚ)
10. Morfologická a strukturní analýza organo-kovových nanočástic připravených elektrokoagulací z polysacharidu mikrobiálního původu (MBÚ)
11. Účast mikroorganismů při patogenezi střevních zánětů (MBÚ)
12. Multivalentní značená glykomimetika v lokalizaci a terapii nádorů (MBÚ)
13. Celogenomová analýza genové exprese ve vyvíjejícím se samčím gametofytu Arabidopsis thaliana (ÚEB)
14. Molekulární mechanismy organizace mikrotubulů u rostlin (ÚEB)
15. Úloha fosfolipidového signálního systému v obranných reakcích rostlin (ÚEB)
16. Použití superparamagnetických nanočástic pro MR zobrazování implantovaných kmenových buněk (ÚEM)
17. Vývoj nových strategií kultivace a řízené diferenciace embryonálních kmenových buněk (ÚEM)
18. Genotoxicita znečištěného ovzduší (ÚEM)
19. Aktivita "universálního" rostlinného promotoru 35s v kultivovaných lidských buňkách (ÚMBR)
20. Prioritní popis výskytu fytoplazmy na Helichrysum bracteatum (ÚMBR)
21. LIME: Nový adaptorový protein asociovaný s membránovými mikrodoménami, který se účastní signalizace prostřednictvím koreceptorů CD4 a CD8 (ÚMG)
22. Ovlivnění žírných buněk gangliosidy vede k inhibici Fc?RI-indukované degranulace snížením aktivity fosfolipázy C? (ÚMG)
23. Mouse SAGE Site: databáze veřejně dostupných myších SAGE knihoven (ÚMG)
24. Využití embryí prasat v biomedicínském výzkumu (ÚŽFG)
25. Obranná mise fagocytů při likvidaci bakterií může být prodloužena ve zralém imunitním systému (ÚŽFG)
26. Reofilní sladkovodní ryby jsou významným modelem pro pochopení historie vlivu klimatických změn v Evropě (ÚŽFG)

5.1 Analýza vazebných vlastností nádorového supresoru proteinu p53
Emil Paleček a kol.

Nádorový supresor, protein p53, hraje klíčovou úlohu ve vzniku rakoviny. Jeho mutovaná forma byla nalezena ve více jak 50% lidských nádorů. V roce 1997 jsme ukázali, že p53 se váže přednostně na nadšroubovicovou (superhelikální, sc) DNA, i když neobsahuje responzi-bilní element, a v průběhu dalších let jsme tento nový typ vazby charakterizovali.
Nedávno jsme zjistili, že i sekvenčně specifická vazba proteinu p53 je zesílena vlivem superhelicity DNA. Pomocí nové, námi navržené kompetiční metody jsme ukázali, že responzibilní element v superhelikální DNA je lepším kompetitorem, než tentýž element v lineární DNA. Nejlepšími kompetitory byly DNA s extrudovanou křížovou formou. Odstranění této lokální struktury vedlo ke snížení kompetičních schopností DNA. Deleční mutanty proteinu p53 C?30 a centrální doména p53 (core domain, aa 93-312) nevykazovaly výraznou preferenci pro superhelikální DNA, což nasvědčuje tomu, že C-koncová doména hraje klíčovou roli při vazbě p53 na superhelikální DNA. Kruciformy či ohyb DNA přispívají k zesílení vazby proteinu p53 k scDNA a superhelicita je důležitým faktorem ve vazebné aktivitě proteinu p53. Na základě těchto výsledků jsme navrhli, že v komplexní regulační síti p53, sekvenčně specifická vazba tohoto proteinu na DNA není ovlivňována pouze jeho vlastnostmi a cílovou sekvencí nukleotidů v DNA, jak bylo dosud předpokládáno; důležitou úlohu mohou hrát i další vlastnosti DNA, včetně lokální hustoty nadšroubovice DNA a schopnosti dané cílové sekvence podléhat konformačním změnám.

Brazda, V., Palecek, J., Pospisilova, S., Vojtesek, B. and Palecek, E. Specific modulation of p53 binding to consensus sequence within supercoiled DNA by monoclonal antibodies. Biochem Biophys Res Commun 267, 934-939, 2000
Brazdova, M., Palecek, J., Cherny, D. I., Billova, S., Fojta, M., Pecinka, P., Vojtesek, B., Jovin, T. M. and Palecek, E. Role of tumor suppressor p53 domains in selective binding to supercoiled DNA. Nucleic Acids Res 30, 4966-4974, 2002
Palecek, E., Brazdova, M., Brazda, V., Palecek, J., Billova, S., Subramaniam, V. and Jovin, T. M. Binding of p53 and its core domain to supercoiled DNA. Eur J Biochem 268, 573-581, 2001
Palecek, E., Brazda, V., Jagelska, E., Pecinka, P., Karlovska, L. and Brazdova, M. Enhancement of p53 sequence specific binding by DNA supercoiling. Oncogene, 2003 (In Press)

5.2 Uspořádání genů, chromosomů a genomu v interfázním jádře zdravých a nádorových buněk a jeho vztah ke genové expresi
Stanislav Kozubek a kol.

Užitím automatizované konfokální mikroskopie, trojrozměrné fluorescenční hybridizace in situ a řady dalších technik molekulární a buněčné biologie jsme dokončili systematickou studii prostorového uspořádání genetických elementů a jeho vztahu ke genové expresi v jádrech zdravých a nádorových buněk. Nejdůležitější závěry jsou tyto: (i) nenáhodné radiální uspořádání genomu odpovídá genové aktivitě tak, že klastry aktivních genů se nacházejí uvnitř jádra, zatímco neaktivní genetické oblasti jsou zpravidla na jeho povrchu nebo na povrchu jadérek, (ii) struktura chromatinu vyššího řádu je překvapivě podobná pro různé lidské buněčné typy, což koreluje se skutečností, že také expresní profily jsou u různých tkání podobné, (iii) vzájemné polohy chromozomů pod povrchem jaderné membrány jsou v zásadě náhodné, existují však výjimky, kdy některé lokusy jsou spolu asociovány, (iv) podali jsme přímý důkaz toho, že chromozomy v interfázi jsou polární a v jádře orientovány; uspořádání chromozomových teritorií odpovídá jejich expresním profilům, (v) uspořádání genomu, chromozomů a polohy genů se mohou významně lišit u nádorových buněk, měnit při diferenciaci nebo v průběhu apoptózy, (vi) tyto změny jsou genetického nebo epigenetického původu; epigenetické jevy se projevují jako změny prostorové struktury chromatinu (kondenzace nebo rozvolnění) a mají za následek aktivaci nebo umlčování genů. Studiem mechanismů epigenetických jevů pomocí transfekce živých buněk HP1-GFP konstrukty jsme ukázali, že při umlčování genů hrají důležitou roli heterochromatinická ohniska formovaná HP1 proteinem; nepřítomnost tohoto proteinu v terminálně diferencovaných buňkách svědčí o existenci dalšího - dosud zcela neznámého - mechanizmu formování heterochromatinu a umlčování genů.

Bártová E., Kozubek S., Jirsová P., Kozubek M., Gajová H., Lukášová M, Skalníková M., Gaňová A., Koutná I., Hausmann M.: Nuclear structure and gene activity in human differentiated cells., J. Struct. Biol. 139(2), p. 76-89, 2002
Kozubek S., Lukášová E., Jirsová P., Koutná I., Kozubek M., Gaňová A., Bártová E., Falk M., Paseková R.: 3D Structure of the Human Genome: Order in Randomness, Chromosoma, 111, p. 321-331, 2002
Lukášová E., Kozubek S., Kozubek M., Falk M., Amrichová J.: The 3D structure of human chromosomes in cell nuclei. Chromosome Research, 10, 535-548, 2002
Amrichová J., Lukášová E., Kozubek S., Kozubek M., Jirsová P.: Nuclear and territorial topography of chromosome telomeres in human lymphocytes. Exp.Cell Res. 289, p.11-26, 2003
Bártová E., Jirsová P., Fojtová M., Souček K., Kozubek S.: Chromosomal territory segmentation in apoptotic cells. CMLS 60, 1-12, 2003
Taslerová R., Kozubek S., Lukášová E., Jirsová P., Bártová E., Kozubek M.: Arrangement of chromosome 11 and 22 territories, EWS and FLI-1 genes, and other genetic elements of these chromosomes. Hum. Genet. 112, p. 143-155, 2003
Lukášová E., Kozubek S., Falk M., Kozubek M., Žaloudík J., Vagunda V., Pavlovský Z.: Topography of genetic loci in the nuclei of cells of colorectal carcinoma and adjacent tissue of colonic epithelium. Chromosoma (In press), 2004

5.3 Struktura a evoluce pohlavních chromosomů modelového dvoudomého druhu Silene latifolia
Boris Vyskot a kol.

Pomocí progresivních technik molekulární a buněčné biologie byly realizovány výrazné objevy v oblasti studia modelových rostlinných pohlavních chromosomů. Byl izolován a charakterizován jeden z prvních funkčních genů vázaných na X a Y chromosom (DD44). Genomový klon DD44 byl taktéž využit i k základnímu fyzikálnímu mapování pohlavních chromosomů. Byl izolován MADS-boxový gen SlAP3 a prokázán jeho duplikativní přenos z autosomu na chromosom Y. Genomovým sekvenováním a imunohistologickou analýzou byla sledována funkce metylace DNA. Byla zkonstruována a skrínována parciální BACová knihovna S. latifolia a využita ke spektrálnímu mapování tohoto modelového rostlinného genomu. Metodou laserové mikrodisekce a zdokonalené techniky FISH byly identifikovány rozdíly v obsahu repetitivních sekvencí pohlavních chromosomů. Výzkum struktury a evoluce pohlavních chromosomů byl realizován zejména ve spolupráci s University of North Carolina a University of Tokyo.

Kejnovský, E., Vrána, J., Matsunaga, S., Souček, P., Široký, J., Doležel J., Vyskot B.: Localization of male-specifically expressed MROS genes of Silene latifolia by PCR on flow-sorted sex chromosomes and autosomes. - Genetics 158: 1269-1277 (2001)
Žlůvová, J., Janoušek, B., Vyskot B.: Immunohistochemical study of DNA methylation dynamics during plant development. - Journal of Experimental Botany 52: 2265-2273 (2001)
Široký, J., Lysák, M.A., Doležel, J., Kejnovský, E., Vyskot, B.: Heterogeneity of rDNA distribution and genome size in Silene spp. - Chromosome Research 9: 387-393 (2001)
Negrutiu, I., Vyskot, B., Barbacar, N., Georgiev, S., Monéger, F.: Dioecious plants. A key to the early events of sex chromosome evolution. - Plant Physiology 127: 1418-1424 (2001)
Janoušek, B., Matsunaga, S., Kejnovský, E., Žlůvová, J., Vyskot, B.: DNA methylation analysis of a male reproductive organ specific gene (MROS1) during pollen development. - Genome 45: 930-938 (2002)
Lengerová, M., Moore, R.C., Grant, S.R., Vyskot, B.: The sex chromosomes of Silene latifolia revisited and revised. - Genetics 165: 935-938 (2003)
Moore, R.C., Kozyreva, O., Lebel-Hardenack,, S., Široký, J., Hobza, R., Vyskot, B., Grant, S.R.: Genetic and functional analysis of DD44, a sex-linked gene from the dioecious plant Silene latifolia provides clues to early events in sex chromosome evolution. - Genetics 163: 321-334 (2003)
Matsunaga, S., Isono, E., Kejnovský, E., Vyskot, B., Doležel, J., Kawano, S., Charlesworth, D.: Duplicative transfer of a MADS box gene to a plant chromosome. - Molecular Biology and Evolution 20: 1062-1069 (2003)
Lengerová, M., Kejnovský, E., Hobza, R., Macas, J., Grant, S.R., Vyskot, B.: Multicolor FISH mapping of the dioecious model plant, Silene latifolia. - Theoretical and Applied Genetics, in press (2003)
Hobza, R., Lengerová, M., Černohorská, H., Rubeš, J., Vyskot, B.: FAST-FISH with laser pressure microdissected DOP-PCR probe distinguishes the sex chromosomes of the dioecious plant Silene latifolia. - Chromosome Research, in press (2003)

5.4 Nová rodina růstových faktorů pro adenosin deaminázu (ADGF)
(Entomologický ústav)

Objevili jsme rodinu šesti růstových faktorů u octomilky Drosophila melanogaster, které stimulují růst některých typů hmyzích buněk a zároveň fungují i jako enzymy. Jejich enzymatická funkce spočívá v přeměně nukleosidu adenosinu na inosin a je nezbytná pro jejich schopnost stimulovat růst buněk. Znamená to tedy, že tyto proteiny regulují koncentraci adenosinu, a tím řídí i chování buněk. Abychom ověřili, že adenosin deamináza (ADGF) plní podobné funkce i v organizmu in vivo, bylo nutno získat mutace v příslušných genech. Modifikovali jsme proto metodu cílové mutageneze u octomilky a získali mutanty v pěti genech ADGF. Touto modifikací jsme významně přispěli k rozvoji genetických metod u octomilky a jako první laboratoři na světě se nám podařilo získat v jediném pokuse mutace v několika genech najednou včetně kombinací. Mutace v genu ADGF-A, jež má v průběhu vývoje mouchy nejvyšší hladinu exprese, je letální. Tento mutant má zvýšenou hladinu adenosinu v hemolymfě, má poškozené tukové těleso a krevní buňky. Fenotyp mutace ADGF-A připomíná fenotyp pacientů s deficiencí lidského genu pro adenosin deaminázu, jež vede ke zvýšení krevní hladiny adenosinu a poškození krevních buněk - akutní kombinovanou imunodeficienci (SCID). Mechanizmus vzniku SCID je stále nejasný a námi získané mutace mohou být vhodným modelem pro jeho studium.

Žurovec, M., Doležal, T., Gaži, M., Pavlová, E., Bryant, P.J.: Adenosine deaminase-related growth factors stimulate cell proliferation in Drosophila by depleting extracellular adenosine. - Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99: 4403-4408 (2002)
Dolezal, T., Gazi, M., Zurovec, M., Bryant, P.J.: Genetic analysis of the ADGF multigene family by homologous recombination and gene conversion in Drosophila. - Genetics 165: 653-666 (2003)

5.5 Umlčení genu in vivo pomocí RNAi interference zprostředkované virem Sindbis

Úlohu genu v živém organismu lze prokázat jeho funkčním vyřazením. To provedeme buď mutagenezí tohoto genu nebo jeho post-transkripčním umlčením pomocí RNA interference (RNAi). Zatímco cílená mutageneze funguje pouze u klasických modelů (např. Drosophila), RNAi je cestou, jak umlčet geny i u jiných organismů. Zásadním problémem je vnesení interferující dvouvláknové RNA, která by spustila degradaci cílové mRNA, do buněk organismu. Tento problém jsme vyřešili použitím rekombinantního viru Sindbis. Sindbis je RNA virus, který v hostitelské buňce replikuje svůj genom včetně námi vloženého genu v obou směrech, takže vznikající dvouvláknová RNA může spouštět degradaci endogenní mRNA pro tento gen a tak ho umlčet. Tento proces se nám poprvé podařilo prokázat in vivo u bource morušového. Umlčením genu pro transkripční faktor Broad-Complex (BR-C) jsme narušili dva typy procesů během metamorfosy: (i) diferenciaci křídel, očí a nohou dospělců z larválních primordií, a (ii) programovanou smrt larválních snovacích žlaz. Tyto defekty odpovídají účinkům mutací v genu BR-C u drosofily a tudíž ukazují, že úloha genu BR-C při metamorfose hmyzu je evolučně konservovaná. Vedle toho naše výsledky prokázaly, že virus Sindbis je užitečným nástrojem pro genetické "knock-outy" u nových modelových druhů.

Uhlirova, M., Foy, B.D., Riddiford, L.M., Beaty, B.J., Olson, K.E., Jindra, M.: Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 15607-15612 (2003)

5.6 Změny v rozšíření denních motýlů a oteplování klimatu

Analýzou dat v novém atlase rozšíření denních motýlů České republiky jsme prokázali, že i po odfiltrování vlivů daných vzájemnou podobností prostorově blízkých lokalit mají na složení fauny motýlů největší vliv klima a geografická poloha, tj. zeměpisná šířka, délka, a nadmořská výška. Srovnáním výškového rozpětí výskytu jednotlivých motýlů během posledních 50 let jsme prokázali posuny rozšíření 15 druhů do vyšších nadmořských výšek; jen jediný druh posunul své rozšíření do nižších poloh; jedná se o statisticky vysoce významný trend. Druhy, u nichž byly pozorovány změny v rozšíření, netvořily homogenní skupinu z hlediska biotopové vazby, ochranářského statutu či horského resp. nížinného rozšíření. To je v souladu s názorem, že za posuny mohou globální klimatické změny. Jedná se o prvý důkaz tohoto trendu z kontinentální Evropy, který navíc ukazuje, že jmenovaný trend je pozorovatelný již i na poměrně hrubé regionální škále.

Beneš, J., Konvička, M., Dvořák, J., Fric, Z., Havelda, Z., Pavlíčko, A., Vrabec, V., Weidenhoffer, Z.: Motýli České republiky: Rozšíření a ochrana. I.,II. Společnost pro Ochranu Motýlů, Praha, 857 pp. (2002)
Konvicka, M., Maradova, M., Benes, J., Fric, Z., Kepka, P.: Uphill shifts in distribution of butterflies in the Czech Republic: effects of changing climate detected on a regional scale. Global Ecology and Biogeography 12: 403-410 (2003)
Storch, D., Konvicka, M., Benes, J., Martinkova, J, Gaston, K.J.: Distribution patterns in butterflies and birds of the Czech Republic: separating effects of habitat and geographical position. Journal of Biogeography 30: 1195-1205 (2003)

5.7 Esterifikační rychlost cholesterolu a poměr plasmatických triglyceridů a cholesterolu: významný diagnostický ukazatel
RNDr. Milada Dobiášová, DrSc.

Kardiovaskulární onemocnění (KVO) je v ČR příčinou více než 50% úmrtí. Nové teoretické poznatky o mechanizmu poruch metabolismu lipoproteinů pomáhají ke zvýšení efektivnosti vyšetřovacích metod a lepší prognóze onemocnění. Dlouhodobý výzkum metabolické aktivity enzymu lecithin-cholesterol acyltransferázy (LCAT) vedl k objasnění souvislostí mezi rychlostí esterifikace cholesterolu (FER_HDL) a velikostí subpopulací lipoproteinů, které jsou rozhodující pro aterogenní fenotyp. Bylo zjištěno, že FER_HDL je výslednicí komplexních vztahů mezi triglyceridy, HDL-cholesterolem a velikostí lipoproteinových částic. Předpoklad, že FER_HDL může být citlivějším indikátorem poruch než klasické diagnostické metody, byl potvrzen ve studii s 1108 pacienty, kteří podstoupili koronární angiografii. Mezi 17 klasickými parametry (věk, BMI, obvod pasu, krevní tlak, léky, alkohol, cvičení, plasmatický cholesterol, LDL a HDL cholesterol, HDL-neesterifikovaný cholesterol, triglyceridy, FER_HDL, apoB, Log(TG/HDL-C), TC/HDL-C) byl FER_HDL nejvýznamnějším prediktorem pozitivního angiografického nálezu (1). Pokud byl v logistické regresní analýze vynechán FER_HDL, pak nejvýznamnějším prediktorem pozitivního nálezu byl index Log(TG/HDL-C), který byl odvozen již dříve na základě velkého experimentálního souboru (2). Pro praxi mají výsledky význam jak z hlediska prevence KVO tak testování účinnosti léčby hypolipidemiky.

Beneš, J., Konvička, M., Dvořák, J., Fric, Z., Havelda, Z., Pavlíčko, A., Vrabec, V., Weidenhoffer, Z.: Motýli České republiky: Rozšíření a ochrana. I.,II. Společnost pro Ochranu Motýlů, Praha, 857 pp. (2002)
Konvicka, M., Maradova, M., Benes, J., Fric, Z., Kepka, P.: Uphill shifts in distribution of butterflies in the Czech Republic: effects of changing climate detected on a regional scale. Global Ecology and Biogeography 12: 403-410 (2003)
Storch, D., Konvicka, M., Benes, J., Martinkova, J, Gaston, K.J.: Distribution patterns in butterflies and birds of the Czech Republic: separating effects of habitat and geographical position. Journal of Biogeography 30: 1195-1205 (2003)

5.8 Protektivní úloha UCP2 při stárnutí buněk: vliv na tvorbu kyslíkových radikálů v mitochondriích
RNDr. Petr Ježek, DrSc.

V buněčných organelách zvaných mitochondrie probíhá za fyziologických podmínek syntéza ATP ("buněčného platidla"), jejíž nevyhnutelným průvodním jevem je tvorba reaktivních kyslíkových radikálů, k jejichž snížené tvorbě přispívají mitochondriální odpřahující proteiny (UCP). Odpřahující proteiny totiž část energie získané ze substrátů dýchacího řetězce převádějí na teplo za mírného urychlení respirace, přispívajícího ke snížené tvorbě radikálů. Při studiu UCP2 proteinu, jenž byl rekonstituován do umělých lipidových váčků, bylo zjištěno, že je nejvíce aktivován polynenasycenými mastnými kyselinami a váže purinové nukleotidy, které jej inhibují (1). Jeho obsah u mitochondrií nejrůznějších tkání je však velmi malý (1). Dále bylo zjištěno, že v hepatocytech a játrech stimulovaných lipopolysacharidem (LPS), vzrůstá jak mRNA UCP2 genu a množství UCP2 proteinu, tak i schopnost snižovat nadbytečnou tvorbu kyslíkových radikálů (2). Produkce H₂O₂ (tvořeného z radikálů) v mitochondriích byla po stimulaci LPS aktivována GDP, tj. po inhibování UCP2 nukleotidem, produkce H₂O₂ znovu stoupla (2). Funkce UCP2 by tak mohla spočívat v kompenzaci nadbytečné tvorby kyslíkových radikálů.
To je velmi významné, neboť kyslíkové radikály buňky poškozují, mohou vyvolat jejich programovanou smrt a napadají nechráněnou DNA v mitochondriích. Radikály tak významně ovlivňují stárnutí i délku buněčného života.

1) Žáčková, M., Škobisová, E., Urbánková, E., Ježek, P.: Activating ?-6 polyunsaturated fatty acids and inhibitory purine nucleotides are high affinity ligands for novel mitochondrial uncoupling proteins UCP2 and UCP3. J. Biol. Chem. 278: 20761-20769 (2003).
2) Růžička, M., Škobisová, E., Dlasková, A., Šantorová, J., Špaček, T., Garlid, K.D., Modrianský, M., Ježek P.: Stimulation of uncoupling protein UCP2 in rat liver and rat hepatocytes by lipopolysaccharide. Zasláno do J. Biol. Chem.

5.9 Charakterizace mechanismu účinku funkčně specifického dlouhodobě působícího M1 muskarinového agonisty xanomelinu
MUDr. Vladimír Doležal, DrSc.

Vážným problémem farmakologie muskarinových receptorů je nízká selektivita agonistů vůči jednotlivým podtypům muskarinových receptorů. Xanomelin je agonista který vykazuje funkční selektivitu pro podtyp M1. Zkoumání vazebných vlastností xanomelinu ukázalo, že se na M1 receptor váže neobvyklým způsobem v tom, že vykazuje dva velmi rozdílné způsoby vazby. Je to jednak kompetitivní vazba do klasického vazebného místa, jednak vazba odolávající odmytí s poločasem více než 30 hodin, která je na jiné než klasické vazebné místo receptoru. Kompetitivně i irreverzibilně navázaný xanomelin aktivuje M1 receptory a zvyšuje hromadění inozitolfosfátů. Funkčním účinkům kompetitivně i irevezibilně navázaného xanomelinu lze zabránit kompetitivním antagonistou, který však nezabraňuje ireverzibilní vazbě xanomelinu. Neodmyvatelná vazba závisí na délce O-alkylového řetězce xanomelinu, který musí mít čtyři nebo více uhlíků. U purifikovaných receptorů jsme zjistili pouze kompetitivní vazbu avšak jak kompetitivní tak neodmyvatelná vazba se objevily po rekonstituci receptoru do umělé membrány v případě, kdy se vazba xanomelinu měřila po rekonstituci. Tyto výsledky lze nejsnáze vysvětlit za předpokladu, že neodmyvatelná vazba xanomelinu se děje prostřednictvím O-alkylového řetězce, který proniká mezi membránovými oblastmi receptoru a ukotvuje se v membránových lipidech obklopujících receptor. Zdá se, že xanomelin představuje zcela nový typ muskarinového agonisty, pro který je charakteristické dlouhodobé působení vyvolané jeho neodmyvatelnou vazbou. Látky tohoto druhu by mohly být výhodné v situacích, které vyžadují tonickou stimulaci receptorů.

1) Jakubík, J., Tuček, S., El-Fakahany, E. E.: Allosteric modulation by persistent binding of xanomeline of the interaction of competitive ligands with the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J Pharmacol Exp The. 301:1033-41 (2002).
2) Jakubík, J.; Tuček, S., El-Fakahany, E. E.: Role of receptor protein and membrane lipids in xanomelin wash-resistant binding to muscarinic M1 receptor. J Pharmacol Exp Ther. 2003 (v tisku)

5.10 Morfologická a strukturní analýza organo-kovových nanočástic připravených elektrokoagulací z polysacharidu mikrobiálního původu

Obecně jsou jako nanočástice označovány materiály tvořené částicemi o průměru menším než 100 nm. K jejich přípravě byly vyvinuty speciální technologie označované jako nanotechnologie. Tato třída materiálů s novými vlastnostmi má značné uplatnění při přípravě nosičů léků s řízeným uvolňováním účinné látky, v potravinářství, kosmetice, mikroelektronice, ale i při monitorování prostředí atp. Kombinací organických polymerů a anorganických nanočástic lze získat nové vícefukční materiály tzv. "chytré materiály". Nanotechnologie umožňuje přípravu nových adhesivních materiálů, dovoluje měnit viskoelestické vlastnosti polymerů a barviv či vývoj nových kosmetických přípravků. Významnou roli hraje užití nanočástic při konstrukci solárních článků nebo mikropočítačových prvků nové generace. V posledních třech letech se v literatuře objevily zmínky o nano-materiálech biologického původu. S užitím biologických materiálů jako jsou peptidy, nukleové kyseliny, viry či mikroorganismy byly vytvořeny nové organo-kovové kompozitní materiály s vynikajícími vlastnostmi.
V našem výzkumu, jsme studovali vlastnosti rozpustného exopolysacharidu (EPS) produkovaného houbou Claviceps viridis v submersní kultivaci. Při studiu kinetiky růstu, spotřeby substrátu a produkce EPS v submersní kultivaci jsme vytvořili jednoduchý matematický model popisující makroskopickou stechiometrii a dynamiku růstu C.viridis v aerobní submersní kultivaci v baňkách i fermentorech (scale-up poměr 1:200). Průměrná molekulární hmotnost EPS, která byla určena v rozmezí 3.5 ± 0.5 M Da byla pětinásobně vyšší než obvyklá hodnota dosahované při kultivaci jiných hub a bakterií. K isolaci produktu (EPS) byla použita metoda elektrokoagulace. Je to metoda založená na tom, že při elektrolýze kultivačního media dochází ke srážení a elektroflotaci organo-kovových částic vzniklých při reakci iontů z rozpouštějící se elektrody a EPS. Metoda byla doposud efektivně využívána pouze při čištění odpadních vod. V naší práci, citované níže, byla tato metoda poprvé vyžita v biotechnologii. Při užití této nové separační techniky k isolaci EPS z fermentační půdy jsme pozorovali vznik nanočástic. Pro lepší charakterizaci vzniklého materiálu (pravidelných kulových nanočástic) byla užita mikrostrukturální a morfologická analýza pomocí elektronové mikroskopie (SEM), transmisní elektronové mikroskopie (TEM) a röntgenové mikroanalýzy. Sferické nanočástice připravené v přítomnosti trojmocných kovových iontů (Fe, Al) měly kompaktní tvar, zatímco pro dvojmocné ionty (Cu, Cd) jsme nalezli sendvičové uspořádání sférické částice z náhodně složených lamel. Rozměry kulových částic se pohybovaly v rozsahu několika desítek nm a byly závislé na použitém iontu pro elektrokoagulaci. Lze předpokládat, že tento nový materiál může najít využití v medicíně při vývoji nosičů léků s řízeným uvolňováním aktivní složky, dále pak jako imunomodulátor nebo ve fyzikálních aplikacích při konstrukci solárních baterií či ve fotografii případně i v kosmetice a potravinářství.

Flieger M.,Votruba J., Pažoutová S., Kantorová M., Cvak J., Benada O., Kofroňová O.: Způsob fermentační přípravy a isolace extracelulárního glukanu pomocí hub druhu Claviceps sp. PV 2002-4026.
Flieger M., Kantorová M., Prell A., Řezanka T., Votruba J.: Biodegradable plastics from renewable sources. Folia Microbiol. 48, 27- 44 (2003).
Flieger M., Kantorová M., Benešová T., Pažoutová S., Votruba J.: Kinetics of soluble glucan production by Claviceps viridis. Folia Microbiol. 48, 633-638 (2003).
Flieger M., Kantorová M., Benada O., Kofroňová O., Sobotka M., Cvak J., Votruba J.: Preparation of nanoparticles by electrocoagulation from soluble exopolysaccharides produced by Claviceps viridis. Biotechnol. Bioeng., 85, 234-236 (2004).

5.11 Účast mikroorganismů při patogenezi střevních zánětů

Patogeneze idiopatických střevních zánětů (IBD - inflammatory bowel disease; tj. Crohnova choroba a ulcerosní kolitida) zůstává neznáma, přestože se v současnosti objevuje mnoho informací. Bylo dokumentováno, že T buňky se přímo účastní patogeneze IBD: u SCID myší rekonstituovaných CD4⁺ T-buněčnou subpopulací (CD45⁺RB^high) izolovanou z BALB/c myší se vyvine kolitida a tomu lze předejít simultánním přenosem CD45⁺RB^low subpopulace CD4⁺ T-buněk. Experimentální model kolitidy indukované u myší perorálním podáním dextransulfátu sodného (DSS) je velmi rozšířen pro svou podobnost s lidskou ulcerosní kolitidou. Přesný mechanismus slizničního poškození indukovaného DSS není přesně vysvětlen, ale hlavní známkou je místní toxický účinek DSS na slizniční epitelové buňky. Bylo zjištěno, že u tohoto modelu hraje velkou roli adhesivní molekula ICAM-1 (Bendjelloul et al. 2000).
Perorální podání probiotických bakterií nebo živých rekombinantních vakcinačních vektorů odvozených od atenuovaných patogenů nebo komensální mikroflóry může být považováno za alternativní přístup při prevenci a terapii IBD a jiných zánětlivých onemocnění. Zejména nepatogenní probiotické bakterie (laktobacily, bifidobakterie, nepatogenní E. coli) podávané v časném postnatálním období jsou vhodné pro zvýšení slizniční imunity a prevenci alergických stavů (Cukrowska et al. 2002; Lodinová-Žádníková et al. 2003).
Pro výzkum experimentálních idiopatických střevních zánětů (IBD) jsme zvolili imunologicky navozený model založený na přenosu CD4⁺CD45⁺RB^high T buněk z imunokompetentních BALB/c myších dárců do imunodeficientních SCID myší a model, u kterého byl střevní zánět navozen perorálním podáním dextransulfátu sodného. V předchozích pokusech jsme zjistili, že u obou modelů se v bezmikrobních podmínkách kolitida nevyvine, zatímco u myší chovaných v konvenčních podmínkách se během 8 týdnů objeví závažné poškození střeva (Hudcovic et al. 2001; Singh et al. 2001).
Ve snaze identifikovat normální střevní bakterie spouštějící zánět jsme gnotobiologickými technikami zjistili, že nekultivovatelné segmentované filamentózní bakterie spolu se směsí definovaných bakteriálních kmenů, které samy kolitidu nevyvolávají, jsou schopny střevní zánět indukovat.

FBendjelloul F., Malý P., Mandys V., Jirkovská M., Prokešová L., Tučková L., Tlaskalová-Hogenová H.: Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) deficiency protects mice against severe forms of experimentally induced colitis. Clin. Exp. Immunol. 119, 57-63 (2000).
Cukrowska B., Lodinová-Žádníková R., Enders C., Sonnenborn U., Schulze J., Tlaskalová-Hogenová H.: Specific proliferative and antibody responses of premature infants to intestinal colonization with nonpathogenic probiotic E. coli strain Nissle 1917. Scand. J. Immunol. 55, 204-209 (2002).
Hudcovic T., Štěpánková R., Cebra J., Tlaskalová-Hogenová H.: The role of microflora in the development of intestinal inflammation: acute and chronic colitis induced by dextran sulfate in germ-free and conventionally reared immunocompetent and immunodeficient mice. Folia Microbiol. 46, 565-572 (2001).
Lodinová-Žádníková, R., Cukrowska, B., Tlaskalová-Hogenová, H.: Oral administration of probiotic Escherichia coli after birth reduces frequency of allergies and repeated infections later in life (after 10 and 20 years). Int. Arch. Allergy Immunol. 131, 209-211 (2003).
Singh B., Read S., Asseman C., Malmstrom V., Mottet C., Stephens L.A., Štěpánková R., Tlaskalová H., Powrie F.: Control of intestinal inflammation by regulatory T cells. Immunol. Rev. 182, 190-200 (2001).
Tlaskalová-Hogenová H., Tučková L., Lodinová-Žádníková R., Štěpánková R., Cukrowska B., Funda D.P., Stříž I., Kozáková H., Trebichavský I., Sokol D., Řeháková Z., Šinkora J., Fundová P., Horáková D., Jelínková L., Sánchez D.: Mucosal immunity: its role in defense and allergy. Int. Arch. Allergy Immunol. 128, 77-89 (2002).

5.12 Multivalentní značená glykomimetika v lokalizaci a terapii nádorů

Sacharidy jsou nejen strukturální elementy živých buněk a významný zdroj energie, ale hrají zásadní roli v mezibuněčné signalizaci. Tato komunikace je zvláště důležitá při bakteriálních a virových infekcích a při diferenciaci a proliferaci buněk. Nádorové bujení a některé typy imunitní odpovědi jsou právě takové procesy, které jsou zprostředkovány sacharidovými strukturami. Za tyto interakce odpovídají glykoproteiny s vysoce rozvětvenými (multivalentními) sacharidickými strukturami.
Příprava složitých sacharidů patří v organické chemii k nejtěžším problémům. Pro využití v terapii a diagnostice lze však struktury podstatně zjednodušit na základní funkční motiv a složitou proteinovou kostru nahradit jednoduchými syntetickými dendrimery, např. polyamidoaminy, jako v našem případě.
Využitím tohoto konceptu a detailní studií základních vazebných struktur aktivačních receptorů tzv. přirozených zabíječů (NK buňky, které jsou schopné přímo likvidovat nádorové buňky) jsme nalezli nejjednodušší strukturální sacharidický element, schopný vazby a aktivace těchto buněk. Na tyto multifunkční glykodendrimery byla pak připojena fluorescenční značka, která je viditelná např. ve fluorescenčním či konfokálním mikroskopu.
Fluorescenčně značené glykodendrimery umožní sledovat lokalizaci analogických glykomimetik při protinádorové terapii, dále lokalizaci, četnost a aktivitu NK buněk ve zdravých i nádory zasažených tkáních a kromě toho jsou použitelné i v diagnostice při průtokové cytometrii (FACS). V našich experimentech jsme prokázali, že u dříve pripravených glykodendrimerů s protinádorovou aktivitou odpovídá molekulární účinek předpokládanému mechanismu (tj. specifická vazba na NK buňky), což umožní další vývoj a aplikaci těchto slibných protinádorových glykoterapeutik.

Citace

P. Krist, L. Vannucci, K. Sadalapure, A. Patel, K. Bezouška, M. Pospíšil, M. Kuzma, T.K. Lindhorst, L. Petruš, V. Křen. Fluorescent Labelled Thiourea-bridged Glycodendrons. ChemBioChem in press 2004
L. Vannucci, A. Fišerová, K. Sadalapure, T.K. Lindhorst, M. Kuldová, P. Rossmann, O. Horváth, V. Křen, P. Krist, K. Bezouška, M. Luptovcová, F. Mosca, M. Pospíšil: Effects of N-acetyl-glucosamine-coated glycodendrimers as biological modulators in the B16F10 melanoma model in vivo. Int. J. Oncol. 23, 285-296 (2003)
P. Krist, E. Herkommerová-Rajnochová, J. Rauvolfová, T. Semeňuk, P. Vavrušková, J. Pavlíček, K. Bezouška, L. Petruš, V. Křen: Towards an optimal oligosaccharide ligand for rat natural killer cell activation receptor NKR-P1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 11-20 (2001).
T. Semeňuk, P. Krist, K. Bezouška, M. Kuzma, P. Halada, V. Křen: Synthesis of chitooligomer-based glycoconjugates and their binding to rat natural killer cell activation receptor NKR-P1. Glycoconjugate J. 18, 817-826 (2001)

5.13 Celogenomová analýza genové exprese ve vyvíjejícím se samčím gametofytu Arabidopsis thaliana
David Honys*

Samčí gametofyt krytosemenných rostlin (pylové zrno) představuje vysoce redukovanou strukturu uzpůsobenou k produkci dvou spermatických buněk a jejich dopravení k samičímu gametofytu (zárodečnému vaku), kde dojde k oplození.
Vypracovali jsme metodu izolace homogenních populací čtyř přesně definovaných vývojových stadií samčího gametofytu Arabidopsis thaliana (jednobuněčné mikrospory, dvoubuněčný pyl, trojbuněčný nezralý pyl a zralý pyl; Honys a Twell 2004, submitted). DNA genové čipy (Affymetrix) nesoucí přibližně 23 000 různých kódujících sekvencí byly hybridizovány RNA získanou z těchto stadií. Výsledná transkriptomická data byla použita pro srovnávací analýzu transkriptomu (tj. souboru všech kódujících mRNA ve zkoumaném vzorku v daný okamžik) samčího gametofytu se sporofytem v celogenomové šíři (Honys a Twell 2003).
Samčí gametofyt je z fyziologického hlediska prakticky jednobuněčným systémem a proto naše práce představuje v rostlinné říši vůbec první pokus o globální analýzu genové exprese a jejích změn během vývoje jediné buňky. Význam takových pokusů vyvstane, uvědomíme-li si, že regulace genové exprese probíhá na úrovni jednotlivých buněk a není synchronizována v rámci celých orgánů.
Získané výsledky ukázaly zcela unikátní složení gametofytického transkriptomu. Z téměř 11 000 genů aktivních alespoň v jednom stadiu vývoje samčího gametofytu jich bylo přes 3 500 exprimovaných ve zralém pylu. Podíl pylově specifických genů dosáhl extrémních téměř 40%. Popsané geny byly podle své funkce rozděleny do funkčních kategorií (viz. obr.), jejichž zastoupení je v pylu zcela odlišné od somatických pletiv (Honys a Twell 2003). Z metodického hlediska bylo významnější popsání přibližně 9 000 genů aktivních v časných vývojových stadiích (mikrosporách), které byly do té doby známy jen tři. Také byla potvrzena existence dvou striktně oddělených a na sebe navazujících globálních vývojových programů, časného a pozdního, pod jejichž kontrolou probíhá vývoj samčího gametofytu. K přepnutí mezi těmito programy dochází po ukončení druhé haploidní mitosy (Honys a Twell 2004, submitted).

Citace

Honys, D., Twell, D. Comparative analysis of Arabidopsis pollen transcriptome. - Plant Physiol. 132: 640-652 (2003).
Lalanne, E., Honys, D., Johnson, A., Borner, G., Dupree, P., Grossniklaus, U., Twell, D.: AtPIGC and AtPIGA, two components of the glycosylphosphatidylinositol anchor biosynthetic pathway, are required for pollen germination and tube growth in Arabidopsis. - Plant Cell 16: 229-240 (2004).
Honys, D., Twell, D.: Male gametogenesis - In: R.M. Goodman (ed.) Encyclopedia of Plant & Crop Science, Marcel Dekker Inc., New York (2004), in press.
Honys, D., Twell, D.: Transcriptome analysis of developing haploid male gametophytes in Arabidopsis thaliana. - Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2004), submitted.
*ve spolupráci s Prof. Davidem Twellem (University of Leicester, Leicester, LE1 7RH, United Kingdom)

5. 14 Molekulární mechanismy organizace mikrotubulů u rostlin
Pavla Binarová a kol.

Buňky vyšších rostlin jsou unikátní tím, že nemají centra pro zahájení tvorby mikrotubulů podobná centrosomům u živočichů či pólovým tělískům u hub. Přesto se u nich mikrotubuly tvoří a jsou organizovány do mitotického vřeténka a dalších důležitých struktur. Výsledky z literatury poslední doby stále více ukazují, že tato tzv. mimocentrosomální tvorba mikrotubulů je jevem významným zřejmě pro všechny buňky vyšších organismů, vybavené mikrotubulárním cytoskeletem. Objasnění molekulárních mechanismů organizace mikrotubulů u rostlin tedy může pomoci pochopit obecné principy mimocentrosomální tvorby mikrotubulů. Gama-tubulin a s ním asociované proteiny jsou považovány za základní molekulární složky center pro organizaci mikrotubulů u buněk živočišných a u hub. Náš výzkum v oblasti organizace mikrotubulárního cytoskeletu rostlin ukázal, že gama-tubulin je u rostlin přítomen v cytoplasmě, na mikrotubulech, v jádře a na membránách (Binarová et al., 2000, Dryková et al., 2003). Ukázali jsme, že proteinové komplexy obsahující gama-tubulin jsou významné při organizaci mikrotubulů. Vazba gama-tubulinových komplexů na membrány může pak představovat molekulární mechanismus, zaručující flexibilní organizaci mimocentrosomálních mikrotubulů obecně. Vazba části gama-tubulinu na mikrotubuly naznačuje, že tento protein může mít u rostlin ještě jinou roli než je zahájení tvorby mikrotubulů. Souhrnně naše dosavadní výsledky ukazují, že organizace mikrotubulárního cytoskeletu rostlin je značně flexibilní, a její mechanismy jsou zřejmě podobné těm, které působí při mimocentrosomální tvorbě mikrotubulů u buněk živočišných.
(spolupráce s MBÚ AV ČR).

Binarová, P., Cenklová, V., Hause, V., Kubátová, E., Lysák, M., Doležel, J., Bögre, L., Dráber, P.: Nuclear -tubulin during acentriolar plant mitosis. - Plant Cell, 12, 433-442, 2000.
Binarová, P., Cenklová, V., Sulimenko, V., Dryková, D., Volc, J., Dráber, P.: Distribution of gamma-tubulin in cellular compartments of higher plant cells. - Cell Biol. Int. 27(3): 167-169, 2003.
Dryková, D., Cenklová, V., Sulimenko, V., Volc, J., Dráber, P., Binarová, P.: Plant -tubulin interacts with , -tubulin dimers and forms membrane-associated complexes. - Plant Cell, 15, 465 - 480, 2003.

5.15 Úloha fosfolipidového signálního systému v obranných reakcích rostlin
Jan Martinec a kol.

Rostliny jsou nuceny reagovat během svého života na řadu nepříznivých vlivů přicházejících z jejich okolí, jako jsou např. sucho, chlad či napadení patogeny. Existuje celá řada molekulárních mechanismů, které jsou těmito faktory aktivovány a které ve svém důsledku brání rostliny před jejich negativními dopady. Jedním z těchto mechanismů je fosfolipidový signální systém. Tento systém, jehož základními stavebními kameny jsou fosfolipasy štěpící fosfolipidy na další signální molekuly, je zároveň velice univerzální (reaguje na širokou škálu stresů - chlad, sucho, napadení bakteriemi či plísněni) a zároveň velmi specifický (každý ze stresů vyvolává jedinečnou obrannou reakci).
Byly studovány základní složky rostlinné fosfolipidové signální soustavy. Prokázali jsme, že receptor pro inositol-1,4,5 trisfosfát je lokalizován na vnitrobuněčné úrovni na endoplasmatickém retikulu. Toto zjištění podpořilo předpoklad existence alternativního zdroje vápenatých iontů (vedle vakuoly) u rostlin (Martinec et al., 2000). Pomocí hmotové spektrometrie jsme poprvé prokázali fosforylaci jedné z membránově vázaných fosfolipas. Výsledky dále ukázaly, že se tato fosforylace pravděpodobně podílí na regulaci enzymatické aktivity (Novotná et al., 2003)*.

Martinec, J., Feltl, T., Scanlon, C.H., Lumsden, P.J., Macháčková, I.: Localization of high affinity binding site for D - myo inositol 1,4,5-trisphosphate from Chenopodium rubrum. - Plant Physiology 124: 475-483, 2000.
Novotná, Z., Linek, J., Hynek, R., Martinec, J., Potocký, M., Valentová, O.: Plant PIP2 dependent phospholipase D activity is regulated by phosphorylation. - FEBS Letters 554, 50-54, 2003.
*Ve spolupráci s laboratoří Doc. Olgy Valentové, Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT, Praha

5.16 Použití superparamagnetických nanočástic pro MR zobrazování implantovaných kmenových buněk

Dospělým potkanům, kteří měli vytvořenou korovou fotochemickou lézi, jsme implantovali stromální buňky kostní dřeně. Tyto buňky jsme před implantací označili paramagnetickými nanočásticemi, na bázi oxidu železa a pomocí magnetické rezonance jsme in vivo sledovali jejich osud. Buňky jsme implantovali buď přímo do mozku, do opačné hemisféry, než byla vytvořená léze, nebo do femorální žíly. Pomocí elektronového mikroskopu a histologického barvení na železo (berlínskou modří) jsme prokázali přítomnost nanočástic v buňkách. Označené buňky cíleně migrovaly do léze, kde se jich malé procento diferencovalo v neuronální buňky. Nepozorovali jsme žádný rozdíl v počtu implantovaných buněk přítomných v lézi po intravenózní aplikaci či po přímé implantaci do mozku. Magnetickou rezonancí jsme implantované buňky sledovali jako tmavou oblast v místě vpichu, po 7 dnech ztmavla I léze. Ztmavnutí léze přetrvalo po dobu 50 dnů. V naší studii jsme ukázali, že stromální buňky kostní dřeně značené nanočásticemi migrují do místa poškození, a že komerčně dostupné nanočástice (Endorem) lze využít ke značení buněk.

1. Jendelová, P., Herynek, V., De Cross, J., Glogarová, K., Andersson, B., Hájek, M., Syková, E.: Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles. - Magn. Reson. Med. 50: 767-776. (2003) IF=3,250
2. Hudson, J.E., Chen, N., Song, S., Walczak, P., Jendelová, P., Syková, E., Wiling, A.E., Saporta, S., Bickford, P., Sanchez-Ramos, J., Zigova, T. Green fluorescent protein bone marrow cells express hematopoietic and neural antigens in culture and migrate within the neonatal rat brain. - J. Neurosci. Res. (in press) IF=2,956
3. Jendelová, P., Herynek, V., Urdzíková, L., Glogarová, K., Kroupová, J., Bryja, V., Andersson, B., Burian, M., Hájek, M., Syková, E. MR tracking of transplanted bone marrow and embryonal stem cells labeled by iron oxide nanoparticles in rat brain and spinal cord. - J. Neurosci. Res. (in press) IF=2,956

5.17 Vývoj nových strategií kultivace a řízené diferenciace embryonálních kmenových buněk
(Ústav experimentální medicíny)

Rychlý pokrok ve výzkumu embryonálních kmenových buněk významně ovlivňuje oblast vývojové biologie a vyvolává mnohá očekávaní v aplikacích buněčné terapie. S cílem vyvinout takové techniky kultivace a diferenciace embryonálních kmenových buněk, které vylučují kontakt se zvířecím biologickým materiálem a jsou slučitelné s budoucí buněčnou terapií, jsme analyzovali růst a diferenciaci embryonálních kmenových buněk na různých typech degradovatelných a nedegradovatelných porézních hydrogelů. Výsledkem bylo několik hydrogelů s požadovanými vlastnostmi. Dále jsme využili několik buněčných systémů včetně myších oocytů, embryonálních kmenových a karcinomových buněk a časných myších embryí pro studia funkcí regulátorů buněčného cyklu, jako jsou p27 a cykliny, v diferenciaci. U myších embryonálních kmenových buněk jsme vyloučili použitelnost jednoho z nejnadějnějších současných systémů pro stabilní a indukovatelnou expresi genů, reverzního transaktivátoru rtTA2^S-S2 kontrolovatelného tetracyklinem. Očekáváme, že některé naše výsledky a zkušenosti získané s využitím myších embryí a embryonálních kmenových a karcinomových buněk budou rychle a účinně aplikovatelné u embryonálních kmenových buněk izolovaných z lidských embryí.

1. Horák, D., Dvořák, P., Hampl, A., Šlouf, M.: Poly(2-hydroxyethyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate) as a mouse embryonic stem cell support.- J. Applied Polymer Sci., 87:425-432. (2003) IF=0,992
2. Kohoutek, J., Dvořák, P., Hampl, A. Temporal distribution of CDK4, CDK6, D-type cyclins, and p27 in developing mouse oocytes. - Biol. Reprod., 70:139-145, (2004) IF=3,698
3. Anger, M., Bryja, V., Jirmanová, L., Hampl, A., Carrington, M., Motlík, J., Dvořák, P., Kubelka, M. The appearance of truncated cyclin A2 correlates with differentiation of mouse embryonic stem cells. - Biophys. Biochem. Res. Com., 302:825-830. (2003) IF=2,935
4. Horák, D., Kroupová, J., Šlouf, M., Dvořák, P. Poly(2-hydoxyethy l methacrylate)-based slabs as a mouse embryonic stem cell support. - Biomaterials, (in press) IF=3,008
5. Bryja, V., Pacherník, J., Faldíková, L., Krejčí, P., Pogue, R., Nevřivá, I., Dvořák, P., Hampl, A. A role of p27Kip1 in maintaining the levels of D-type cyclins in vivo. - Biochim. Biophys. Acta, (in press) IF=3,883
6. Bryja, V., Pacherník, J., Kubala, L., Hampl, A., Dvořák, P. The reverse tetracycline-controlled transactivator rtTA2S-S2 is toxic in mouse embryonic stem cells. - Reprod. Nutr. Dev., (in press) IF=0,872

5.18 Genotoxicita znečištěného ovzduší

Studie hodnotila biologickou aktivitu komplexních směsí organických látek adsorbovaných na prachové částice z ovzduší (PM10, 10 ?m) během zimního a letního období 2000-2001 na monitorovacích stanicích v Teplicích, Praze-Smíchově (centrum města) a Praze-Libuši (residenční oblast). Byly použity krátkodobé in vitro testy: mutagenity na bakteriálních kmenech Salmonella typhimurium, acelulární test hodnotící schopnost vytvářet DNA adukty s použitím metody 32P-postlabeling a test embryotoxicity na kuřecím zárodku (CHEST). Výsledky testů genotoxicity a embryotoxicity prokázaly vztah mezi biologickou aktivitou a obsahem 8 karcinogenních polycyklických aromatických uhlovodíků (PAU) analyzovaných v EOM (extrahovatelné organické látky). Nejvyšší genotoxicita ovzduší byla pozorována v zimní i letní sezóně v centru Prahy. Získané výsledky dovolují považovat znečištění ovzduší karcinogenními PAU v Praze a Teplicích za významné riziko, které může při dlouhodobém působení nepříznivě ovlivnit zdravotní stav pražské a teplické populace v příštích desetiletích.

Binková, B., Černá, M., Pastorková, A., Jelínek, R., Beneš, I., Novák, J., Šrám, R.J.: Biological activities of organic compounds adsorbed onto ambient air particles : comparisson between the cities of Teplice and Prague during the summer and winter seasons 2000-2001. - Mutation Res. (Fundamentals) 525: 43-59 (2003). IF 3.158

5.19 Aktivita "universálního" rostlinného promotoru 35s v kultivovaných lidských buňkách
VLASÁK, J., ŠMAHEL, M., PAVLÍK, A., PAVINGEROVÁ, D., BŘÍZA, J.

Silný promotor 35S z viru mosaiky květáku je využíván pro expresi cizorodých genů téměř ve všech geneticky modifikovaných (GMO) kulturních plodinách. Promotor pracuje ve všech druzích rostlin, ale vysokou aktivitu má i v bakteriích, kvasinkách a řasách. Aktivita v lidských buňkách by mohla představovat určité riziko při užívání transgenních rostlin, avšak dosud publikované údaje o aktivitě p35S v živočišných buňkách jsou velmi rozporné a o lidských buňkách jsme nenašli žádná relevantní data.
Provedli jsme tedy srovnání transientní exprese signálního genu GUS, řízeného promotorem 35S, v protoplastech tabáku a v různých typech lidských buněk. Různé podmínky pro transfekci DNA a její expresi v různých typech buněk však neumožnily přímé srovnání. Abychom mohli posoudit skutečnou efektivitu promotoru 35S, vyměnili jsme ho ve všech hybridních genech za silný "živočišný" promotor pCMV z lidského cytomegaloviru (hCMV) a výsledky srovnali.
Zjistili jsme, že ve všech typech hybridních genů byla aktivita promotoru 35S asi 10000x nižší než aktivita promotoru z hCMV. To ukazuje, že nebezpečí vyplývající z užívání promotoru 35S v GMO plodinách nebude tak velké, jak se občas tvrdí.
Překvapivě jsme však zjistili, že "živočišný" promotor pCMV má v protoplastech bramboru kupodivu jen 100x nižší účinnost než promotor 35S. Podobnou hladinu exprese vykazuje mnoho přirozených rostlinných genů. Tento fakt musí být brán v úvahu při konstrukcích a použití živočišných vektorů.

Vlasák, J., Šmahel, M., Pavlík, A., Pavingerová, D., Bříza, J.: Comparison of hCMV immediate early and CaMV 35S promoters in both plant and human cells. - J. Biotechnol. 103: 197-202 (2003)

5.20 Prioritní popis výskytu fytoplazmy na Helichrysum bracteatum
FRÁNOVÁ, J., PŘIBYLOVÁ, J., ŠIMKOVÁ, M., NAVRÁTIL, M., VÁLOVÁ, P.

V minulých letech jsme v různých částech České republiky pozorovali rostliny slaměnek (Helichrysum bractearum) s příznaky bronzovitosti listů, nekrózami, nadměrným větvením a abnormalitami květů. Tyto příznaky se vyskytovaly u 2-70% rostlin v závislosti na lokalitě. V elektronovém mikroskopu jsme v sítkovicích nalezli fytoplazmová tělíska. Fytoplazmu jako příčinu onemocnění jsme identifikovali molekulárními metodami. Štěpení amplifikovaného produktu několika restrikčními enzymy a vyhodnocení vzniklých fragmentů nám umožnilo identifikovat fytoplazmu jako jednu ze skupiny žloutenky aster. Srovnáním nukleotidové sekvence jsme zjistili, že se nejvíce podobá jiné fytoplazmě z léčivé a okrasné rostliny Rehmannia glutinosa var. purpurea, kterou jsme identifikovali před lety u nás.

Příklad identifikace fytoplazmy pomocí štěpení amplifikovaného genu 16S rDNA restrikčním enzymem MseI.

Vzhled zdravé (vpravo) a fytoplazmou infikované slaměnky s příznaky abnormálního větvení a malformace květu (vlevo).

Fránová, J., Přibylová, J., Šimková, M., Navrátil, M., Válová, P.: Electron microscopy and molecular characterization of phytoplasmas associated with strawlower yellows in the Czech Republic. - Eur. J. Plant Pathol. 109: 883-887 (2003).

5.21 LIME: Nový adaptorový protein asociovaný s membránovými mikrodoménami, který se účastní signalizace prostřednictvím koreceptorů CD4 a CD8
(Ústav molekulární genetiky)

Na povrchu lymfocytů existují jako funkčně význačné útvary tzv. signalizační mikrodomény. Ty se vyznačují charakteristickým lipidovým složením (jsou bohaté na cholesterol a glykosfingolipidy). Tyto "membránové ostrůvky" obsahují několik molekul kriticky důležitých pro imunoreceptorovou signalizaci (protein kinázy rodiny Src, G-proteiny, transmembránové adaptorové proteiny LAT a NTAL). Autorům se podařilo identifikovat nový adaptorový protein membránových signalizačních mikrodomén T lymfocytů, nazvaný LIME. Lidský LIME je silně bazický polypeptid obsahující 295 aminokyselin. Ve své cytoplasmatické části obsahuje 5 tyrosinových zbytků, které jsou fosforylovány po shluknutí koreceptorů CD4 a CD8. Fosforylovaný protein LIME váže důležitou protein kinázu Lck a její negativní regulátor, kinázu Csk. Vynucená exprese LIME v T-lymfocytární linii Jurkat vede ke zvýšení množství kinázy Csk v membránových mikrodoménách, zvýšené fosforylaci Lck a vyšší odpovídavosti po stimulaci přes T-receptorový komplex. LIME se tedy zřejmě podílí na regulaci aktivity T lymfocytů prostřednictvím koreceptorových molekul. V práci je navržen molekulární model, jak by LIME mohl regulovat aktivitu klíčové kinázy Lck.

Brdičková, N., Brdička, T., Angelisova, P., Horváth, O., Špička, J., Hilgert, I., Pačes, J., Simeoni, L., Kliche, S., Merten, C., Schraven, B., Hořejší, V.: LIME: a new membrane raft-associated adaptor protein involved in CDS4 and CD8 coreceptor signaling. - J. Exp. Med. 198: 1453-1462 (2003).

5.22 Ovlivnění žírných buněk gangliosidy vede k inhibici Fc?RI-indukované degranulace snížením aktivity fosfolipázy C?
Dráberová, L., Dudková, L., Boubelík, M., Tolarová, H., Šmíd, F., and Dráber, P. J. Immunol. 171:3585-3593. 2003.

Práce se zabývá analýzou molekulárních mechanismů inhibičního působení gangliosidů na žírné buňky. Jedná se o významnou výzkumnou problematiku neboť řada nádorových buněk uvolňuje velké množství gangliosidů, které inhibují buňky imunitního systému. Zjistili jsme, že ovlivnění modelové linie žírných buněk vedlo k inhibici sekreční odpovědi vyvolané agregací receptorů s vysokou afinitou pro IgE (Fc?RI). Překvapivým byl nález, že gangliosidy neinhibují časné etapy aktivace, které zahrnují fosforylaci vysokoafinitního receptoru pro IgE (Fc?RI), Syk kinázy a LAT adaptoru. Ačkoliv produkce fosfoinositidů byla snížena, aktivita fosfatidylinositol-3 kinázy nebyla významně ovlivněna. Gangliosidy měly zanedbatelný efekt na asociaci agregovaného Fc?RI s membránovými mikrodoménami plasmatické membrány. Ačkoliv ovlivnění gangliosidy neovlivňovalo asociaci LAT adaptoru s fosfolipázou C (PLC)?1 a PLC?2, tyrosinová fosforylace těchto enzymů a jejich asociace se signalizačními komplexy byla snížena. To vedlo ke snížené produkci volného cytoplasmatického vápníku a tím k útlumu následných aktivačních dějů. Tyto a některé další výsledky nás vedly k závěru, že gangliosidy ovlivňují ty vlastnosti membránových mikrodomén, které jsou významné pro vytváření signalizačních komplexů obsahujících PLC?.

5.23 Mouse SAGE Site: databáze veřejně dostupných myších SAGE knihoven
Divina, P., Forejt, J.: Nucleic Acids Res. 32(1): D482-3, 2004.

Databáze "Mouse SAGE Site" shromažďuje data získaná z expresního profilování genů v myších tkáních a buněčných liniích pomocí metody SAGE (sériová analýza genové exprese). Expresní data z myších SAGE knihoven veřejně dostupných na Internetu popř. v publikacích byla jednotně zorganizována a zpřístupněna vědecké komunitě ve formě webové databáze. V současné době databáze obsahuje 65 myších SAGE knihoven (asi 2 500 000 SAGE tagů). Databáze je jedinečným zdrojem myších genových expresních dat a umožňuje interaktivní práci včetně prohlížení, srovnávání a prohledávání SAGE dat pomocí několika snadno ovladatelných webových nástrojů. Databáze využívá vylepšenou metodu identifikace SAGE tagů ke genům založenou na databázi SAGEmap. Databáze je veřejně přístupná bez omezení na internetových stránkách http://mouse.biomed.cas.cz/sage/ a je průběžně aktualizována novými veřejně dostupnými SAGE knihovnami z myších tkání a buněk.

5.24 Využití embryí prasat v biomedicínském výzkumu

Současný pokrok v reprodukční biotechnologii zvyšuje šance na využití geneticky modifikovaných buněk, tkání nebo i celých orgánů prasete v biomedicínském výzkumu. Produkce embryí prasat metodami in vitro je klíčovým krokem v různých strategiích vedoucích k přípravě geneticky modifikovaných tkání prasete. Tvorba chimér kombinací tetraploidních embryí s embryonálními kmenovými buňkami (ESC) se ukázala být alternativou klonování nebo alternativou mikroinjekce DNA na cestě k vytváření geneticky modifikovaných organizmů. Např. injekcí geneticky modifikovaných ESC do tetraploidních blastocyst lze získat transgenní myši, jejichž buňky pocházejí výhradně z injikovaných ESC. Kromě ESC lze k podobným účelům použít i buňky embryoblastu, např. u živočišných druhů, u kterých nejsou ESC zatím k dispozici. Výše popsaný systém lze dále použít ke studiu schopností tkáňově specifických kmenových buněk přispívat do různých tkání během embryonálního vývoje. V naší laboratoři budeme sledovat integraci tkáňově specifických kmenových buněk do embryonálních a fetálních tkání prasete. V první etapě toho projektu jsme se zabývali kultivací časných embryí prasat, diploidních i tetraploidních, s cílem zvládnout celý preimplantační vývoj, tj. ze stádia zygoty do stádia blastocysty, v prostředí in vitro. Pro tento účel bylo použito modifikované médium NCSU 37, které umožnilo vývoj embryí prasat přes kritické stádium čtyř buněk, kdy se aktivuje embryonální genom. Zygoty či dvoubuněčná embrya byla získávána výplachem vejcovodů a kultivována v médiu po dobu 6-7 dnů. Tetraploidní embrya byla produkována elektricky stimulovanou fůzí dvoubuněčných embryí a jejich ploidita byla vyšetřována detekcí počtu chromozomů 1 a 10 metodou hybridizace in situ. Podařilo se nám vypracovat systém, ve kterém se více než 80 % diploidních i tetraploidních embryí úspěšně vyvíjí do stádia blastocysty.

Blastocysta prasete získaná kultivací zygoty in vitro

   

Procházka, R., Vodička, P., Zudová, D., Rybář, R., Motlík, J.: Development of in vivo derived diploid and tetraploid pig embryos in a modified medium NCSU 37. Theriogenology (2004; in press).

5.25 Obranná mise fagocytů při likvidaci bakterií může být prodloužena ve zralém imunitním systému

Reakce imunitního systému na bakteriální invazi jsou předmětem zájmu z důvodu objasnění mechanizmů imunitní odpovědi, a to především v souvislosti s narůstající rezistencí bakterií k antibiotikům, nedostatku alternativních účinných terapií a také rostoucímu množství patogenů. Fagocytóza představuje jeden ze základních obranných mechanizmů, který je uplatňován buňkami imunitního systému. Fagocytóza je doprovázena aktivací apoptotického programu fagocytů. Srovnání aktivace apoptotického programu u fagocytujících buněk (granulocytů) po pohlcení mikrosférických partikul, mrtvých bakterií nebo živých bakterií (Salmonella typhimurium), a to v různých fázích postnatálního vývoje prasete, ukázalo, že nástup apoptózy závisí nejenom na charakteru pohlcených částic, ale také na úrovni zralosti imunitního systému (ten u prasat maturuje až postnatálně). Přítomnost živých fagocytovaných bakterií může apoptotickou aktivaci oddálit, a tak prodloužit jinak velmi krátký život fagocytů. K tomuto procesu nicméně dochází zřejmě až v pozdních fázích maturace imunitního systému.

Matalová, E., Španová, A., Kovářů, F.: Apoptotic DNA alterations in pig leukocytes after phagocytosis of bacteria are linked to maturation of the immune system. Physiol. Res. 52: 235 - 242. (2003).

5.26 Reofilní sladkovodní ryby jsou významným modelem pro pochopení historie vlivu klimatických změn v Evropě

Reofilní (proudomilné) typy sladkovodních ryb (např. parmy rodu Barbus, vranky rodu Cottus nebo sekavci rodu Sabanejewia) jsou ohroženou skupinou ryb vzhledem k drastickým změnám těchto ekosystémů, na které jsou velmi přísně vázány.Vzhledem k tomu, že nejsou schopny překonat jiné typy sladkovodních ekosystémů, jsou proto neobyčejně vhodným modelem pro porozumění rozšíření sladkovodních organizmů vlivem klimatických cyklů. Současné molekulárně genetické znaky a jejich fylogeografická interpretace umožňuje rekonstruovat historii jejich rozšířování s dosud nebývalou přesností. Např. parma říční Barbus barbus měla v meziledových dobách refugium v oblasti Černého moře, kde došlo k výraznému odlišení několika vývojových linií, z nichž ale pouze jedna dokázala rekolonizovat evropské řeky po posledním zalednění. Sekavci rodu Sabanejewia osídlili oblast dunajského povodí vícekrát (nejméně dvakrát), avšak mimodunajské populace mají velmi úzký vztah k ponto-kaspickému refugiu v oblasti severního Iránu. Zcela mimořádnou historii mají také vranky rodu Cottus, u jejichž populací byla prokázána schopnost překonávat i rozvodí mezi říčními systémy jevem označovaným jako říční pirátství a jejich populace jsou proto geneticky značně promíšené v rozsáhlé oblasti střední Evropy. Tyto příklady ukazují, že pro vědecky hluboce podloženou ochranu biodiverzity sladkovodních ryb je nezbytné použití molekulárně genetických přístupů, abychom porozuměli tomu, jak se formovaly a jakou mají evoluční historii současné populace ryb žíjích u nás

Kotlík, P., Bogutskaya, N.G., Ekmekci, F.G.: Circum Black Sea phylogeography of freshwater fishes Barbus: divergence in Pontic glacial refugium. Molecular Ecology,13: 87 - 95, (2004).
Perdices, A., Doadrio, I., Economidis, P.S., Bohlen, J., Banarescu, P.: Pleistocene effects on the European freshwater fish fauna: double origin of the cobitid genus Sabanejewia in the Danube basin (Osteichthyes: Cobitidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 26: 289 - 299, (2003).
Šlechtová, V.: Importance of the Alps as a barrier to dispersal in cold-adapted freshwater fishes: Phylogeography and taxonomic state of the bullhead in the Adriatic freshwater drainage with implications to bullhead diversity. Diplomová práce JU, České Budějovice, (2003).