5. Sekce biologických a lékařských věd
Seznam anotací:
- Anomální struktury trinukleotidových opakování (GCC) a (GGC) související s fragilitou chromozómu X (B) (BFÚ)
- Interakční cesty telomer-vazebných proteinů rostlin (BFÚ)
- Mechanismy působení nového vysoce účinného derivátu cisplatiny LA-12 (BFÚ)
- Objev proteinu MBF1 s ochrannou funkcí proti oxidativnímu stresu (ENTÚ)
- Nový odhad druhového bohatství herbivorního hmyzu v tropických lesích (ENTÚ)
- Fylogeneze, struktura a funkce hmyzích telomer (ENTÚ)
- Společný mechanismus udržování vysokého krevního tlaku u různých forem hypertenze (FGÚ)
- Membránové mikrodomény v hormonální signalizaci (FGÚ)
- Nový enzym cukerného metabolismu (MBÚ)
- Taxonomie námele (MBÚ)
- 2,3-Dehydrosylibin - nová látka v terapii lupénky a dermatitid (MBÚ)
- 2,3-extradiolové štěpení L-DOPA je následováno intramolekulární cyklizací štěpného produktu (MBÚ)
- Analýza genomu pšenice pomocí tříděných chromozómů (ÚEB)
- Reparace dvojvláknových zlomů DNA v rostlinách (ÚEB)
- Kyselina fosfatidová (PA) produkovaná fosfolipázami D (PLD) se účastní regulace buněčné expanse rostlin (ÚEB)
- Aktin a myosin I se podileji na transkripci genu (ÚEM)
- Difúzní parametry extracelulárního prostoru v mozku transgenních APP23 myší - model Alzheimerovy choroby (ÚEM)
- Analýza mutací viroidu pstv vyvolaných teplotním šokem a biolistickou inokulací u potomstva viroidních termomutantů rajčete a řepky (ÚMBR)
- Objasnění genetické diverzity světové populace TuMV (ÚMBR)
- Negativní regulace funkcí žírných buněk a přenosu signálů v nich adaptorovým proteinem LAB/NTAL (ÚMG)
- Vazba nového fenylnorstatinového inhibitoru k HIV-1 protease: Geometrie, protonace a interakce ve vazebných kapsách ve struktuře s atomovým rozlišením (ÚMG)
- Charakterizace kuřecích genů kódujících receptorové molekuly pro ptačí sarkomové a leukózové viry podskupiny A a C (ÚMG)
- Možnosti přirozené náhrady trvalých zubů? (ÚŽFG)
- Anaerobní houby u přežvýkavců (ÚŽFG)
- Určení genů zodpovědných za vznik melanomových nádorů u laboratorních prasat MeLiM (ÚŽFG)
5.1 Anomální struktury trinukleotidových opakování (GCC) a (GGC) související s fragilitou chromozómu X (B)
Michaela Vorlíčková a kol.
Syndrom fragilního chromozomu X je nejběžnější dědičnou formou mentální retardace. Vznik nemoci souvisí s prodloužením opakovaných tripletů GCC v jednom a GGC ve druhém řetězci jeho DNA. Zjistili jsme, že oba trinukleotidové motivy tvoří různé intramolekulární struktury a že pravděpodobnou příčinou jejich prodlužování v genomu je náchylnost obou řetězců tvořit vlásenky.
Fojtík, P. and Vorlíčková, M.: The fragile X chromosome (GCC) repeat folds into a DNA tetraplex at neutral pH. Nucleic Acids Res. 29: 4684-4690, 2001
Fojtík, P., Kejnovská, I. and Vorlíčková, M.: The guanine-rich fragile X chromosome repeats are reluctant to form tetraplexes. Nucleic Acids Res. 32: 298-306, 2004
5.2 Interakční cesty telomer-vazebných proteinů rostlin
Jiří Fajkus a kol.
Telomer-vazebné proteiny jsou nezbytné pro tvorbu funkční nukleoproteinové struktury konců chromosomů a pro regulaci činnosti telomerázy. Na základě vyhledávání homologií s konzervativními doménami telomer-vazebných proteinů jiných organismů byla identifikována řada kandidátních proteinů u rostlin a testována jejich afinita k telomerové DNA in vitro.
Abychom získali údaje relevantní k možné telomerové funkci těchto proteinů, vytvořili jsme soubor cDNA kandidátních telomer-vazebných proteinů Arabidopsis thaliana k analýze jejich protein-proteinových interakcí pomocí kvasinkového dvojhybridního systému a imuno-precipitace.
Naše výsledky ukazují, že AtTRP1, jeden ze skupiny proteinů nesoucích Myb doménu na svém C-konci, interaguje specificky s proteinem AtKu70, jehož funkce na telomerách je známa. Analogicky k známé interakci mezi lidskými proteiny Ku70 a TRF2 naše výsledky nasvědčují tomu, že AtTRP1 je pravděpodobným rostlinným homologem TRF2, proteinu klíčového pro ochrannou funkci telomer u savců. Za interakci s AtKu70 zodpovídá oblast 80-269 aminokyselinové sekvence AtTRP1. Protein AtTRB1, patřící do skupiny rodiny Smh (single-myb-histone), která obsahuje Myb doménu na N-konci, tvoří homomerní komplexy a komplexy s dalšími členy Smh rodiny (AtTRB2, AtTRB3). Na rozdíl od nich ale AtTRB1 interaguje také s proteinem AtPot1, rostlinným homologem proteinů skupiny Pot1, které vykazují vazbu k jednovláknovému přesahu G-bohatého vlákna telomerové DNA. U člověka může být Pot1 poután k telomerám i protein-proteinovými interakcemi s komplexem TRF1, a tak se účastní na regulaci délky telomer. AtTRB1 může mít podobnou funkci v přitahování AtPot1 k rostlinným telomerám. Naše výsledky tak poskytují důkaz o síti interakcí, které regulují homeostázi telomer u rostlin.
Schrumpfová P., Kuchař M., Miková G., Skříšovská L., Kubičárová T. and Fajkus J.: Characterization of two Arabidopsis thaliana myb-like proteins showing affinity to telomeric DNA sequence. Genome 47: 316-324, 2004
Kuchař M. and Fajkus J.: Interactions of putative telomere-binding proteins in Arabidopsis thaliana: identification of functional TRF2 homolog in plants. FEBS Letters 578: 311-315, 2004
5.3 Mechanismy působení nového vysoce účinného derivátu cisplatiny LA-12
Alois Kozubík a kol.
Hlavním cílem práce bylo poznání mechanismů účinků nově vyvinutého vysoce účinného cytostatika - čtyřmocného platinového derivátu s kódovým názvem LA-12 [(OC-6-43)-bis(acetato) (1-adamantylamine) ammine dichloro platinum(IV)] (1). Tato látka byla vybrána na základě srovnávacích studií, v nichž byla testována řada strukturně příbuzných derivátů (2). Byly získány prioritní výsledky prokazující, že LA-12 vykazuje mnohonásobně vyšší protinádorové působení oproti cisplatině u celé škály nádorových linií včetně ovariálních nádorových buněk A2780 a překonává rezistenci těchto buněk k cisplatině (2, 3). U ovariálních buněk (rodičovských i se získanou rezistencí k cisplatině) bylo prokázáno, že za mechanismus účinků LA-12 by mohly být odpovědné změny v regulaci buněčného cyklu a apoptózy. LA-12 indukovala přechodnou kumulaci buněk obou linií v S-fázi buněčného cyklu a vyvolala nárůst hladiny proteinu p53. LA-12 se v současnosti nachází v první fázi klinického testování a dosažené výsledky jsou klíčové pro její správné terapeutické využití.
Žák F., Turánek J., Kroutil A., Sova P., Mistr A., Poulová A., Mikolin P., Žák Z., Kašná A., Záluská D., Neča J., Šindlerová L., Kozubík A.: Platinum(IV) complex with adamantylamine as nonleaving amine group: Synthesis, characterization, and in vitro antitumor activity against a panel of cisplatin-resistant cancer cell lines. Journal of Medicinal Chemistry 47 (3): 761-763, 2004
Turánek J., Kašná A., Záluská D., Neča J., Kvardová V., Knötigová P., Horváth V., Šindlerová L., Kozubík A., Sova P., Kroutil A., Žák F., Mistr A.: New platinum (IV) complex with adamantylamine ligand as a promising anti-cancer drug: comparison of in vitro cytotoxic potential towards A2780/cisR cisplatin-resistent cell line within homologous series of platinum (IV) complexes. Anti-cancer Drugs 15: 537-543, 2004
Kozubík A., Horváth V., Švihálková-Šindlerová L., Souček K., Hofmanová J., Sova P., Kroutil A., Žák F., Mistr A., Turánek J.: High effectiveness of platinum(IV) complex with adamantylamine in overcoming resistance to cisplatin and suppressing proliferation of ovarian cancer cells in vitro. Biochemical Pharmacology (in press) 2004
5.4 Objev proteinu MBF1 s ochrannou funkcí proti oxidativnímu stresu
Oxidativní stres volnými radikály přispívá k degenerativním onemocněním a stárnutí. Organismy proto mají vůči oxidantům obranné mechanismy. Ty jsou spouštěny aktivací signálních drah a následně transkripčních faktorů, mezi jinými proteinu Jun. Již před 15 lety bylo zjištěno, že Jun obsahuje cysteinový zbytek náchylný k oxidaci, který omezuje DNA-vazebnou aktivitu Jun. Záměna tohoto cysteinu přispívá k nadměrné onkogenní funkci Jun. Způsob, jakým buňky stupeň oxidace Jun regulují, však není jasný. Zjistili jsme, že na protein Jun se v blízkosti kritického cysteinu váže kofaktor MBF1, který chrání tento cystein před oxidací a zachovává DNA-vazebnou aktivitu Jun za podmínek, kdy je Jun bez MBF1 zcela inaktivní. Abychom prokázali funkci MBF1 v živém organismu, připravili jsme mutantní kmen mouchy Drosophila melanogaster postrádající gen pro MBF1. Vývojový proces závislý na Jun je u těchto much citlivý na oxidant peroxid vodíku, což naznačuje důležitost MBF1 pro aktivitu Jun také in vivo. Mouchy bez proteinu MBF1 sice přežívají, za přítomnosti peroxidu však hynou dříve než mouchy normální. Ačkoli tedy MBF1 není nezbytný k životu za příznivých podmínek, poskytuje důležitou výhodu při oxidativním stresu. Vzhledem k vysoké podobnosti MBF1 u much a savců by mohl MBF1 hrát podobnou roli v biologii člověka.
Jindra, M., Gaziova, I., Uhliřova, M., Okabe, M., Hiromi, Y., Hirose, S. Coactivator MBF1 preserves the redox-dependent AP-1 activity during oxidative stress in Drosophila. - EMBO J. 23: 3538-3547 (2004).
5.5 Nový odhad druhového bohatství herbivorního hmyzu v tropických lesích
Ukázali jsme, že neplatí učebnicové představy o herbivorním hmyzu v tropických lesích vytvářejícím druhově velmi bohatá a specializovaná společenstva s proměnlivou, obtížně předpověditelnou skladbou. Náš výzkum na Papui-Nové Guineji vyvrátil hypotézu, že koexistence vysokého počtu druhů herbivorů v tropických lesích je umožněna jejich úzkou hostitelskou specializací, redukující vzájemnou mezidruhovou konkurenci. Naopak jsme zjistili, že většina hmyzích herbivorů využívá několik, obvykle blízce příbuzných druhů hostitelských rostlin a že herbivorní společenstva na různých druzích tropických stromů mají společné strukturní znaky, včetně dominanční struktury. Tyto výsledky vedly k revizi odhadu celosvětové druhové diverzity hmyzu z 30 na 5 milionů druhů, neboť původní vysoký odhad byl založen na předpokladu úzké hostitelské specializace hmyzích herbivorů. Přesné stanovení lokální i globální biodiverzity je důležité nejen pro pochopení funkce druhově bohatých ekosystémů, ale také pro ochranu druhového bohatství planety.
Novotny, V., Basset, Y., Miller, S. E., Kitching, R., Laidlaw, M., Drozd, P., Cizek, L. Local species richness of leaf-chewing insects feeding on woody plants from one hectare of a lowland rainforest. - Conservation Biology 18: 227-237 (2004)
Novotny, V., Basset, Y., Miller, S.E., Weiblen, G.D., Bremer, B., Cizek, L., Drozd, P. Low host specificity of herbivorous insects in a tropical forest. - Nature 416: 841-844 (2002)
Novotny, V., Miller, S. E., Basset, Y., Cizek, L., Drozd, P., Darrow, K., Leps, J. Predictably simple: communities of caterpillars (Lepidoptera) feeding on rainforest trees in Papua New Guinea. - Proceedings of the Royal Society, London, Biological Sciences 269: 2337-2344 (2002)
Novotny, V., Miller, S. E., Leps, J., Bito, D., Janda, M., Hulcr, J., Basset, Y., Damas K., Weiblen, G. D. No tree an island: the plant-caterpillar food web of secondary rainforest in New Guinea. - Ecology Letters 7: 1090-1100 (2004)
5.6 Fylogeneze, struktura a funkce hmyzích telomer
Telomery jsou nukleoproteinové struktury na koncích chromosomů s řadou životně důležitých funkcí. Telomerická DNA je tvořena bloky krátkých opakujících se sekvencí DNA, u hmyzu byla zjištěna sekvence (TTAGG)n. Prokázali jsme, že sekvence (TTAGG)n je původním motivem telomer nejen hmyzu, ale i všech členovců. U řady hmyzích řádů byla však tato sekvence opakovaně ztracena a nahrazena jiným motivem. Tyto časté evoluční změny ve struktuře telomer naznačují existenci záložního mechanismu ochrany konců chromosomů. Naopak u ostatních "nehmyzích" skupin členovců je telomerická sekvence (TTAGG)n vysoce konzervována s výjimkou pavouků (Aranea). Dále jsme zjistili, že telomery příbuzných skupin členovců jsou buď tvořeny sekvencí "obratlovčí", (TTAGGG)n (drápkovci, Onychophora), nebo nemají žádnou z těchto sekvencí (želvušky, Tardigrada). Sekvence (TTAGG)n se pravděpodobně vyvinula mutací sekvence (TTAGGG)n u společného předka všech členovců v prekambriu (pravděpodobně v ediakaranu) před více jak 545 miliony let. Na základě našich výsledků a literárních údajů jsme formulovali hypotézu, že tzv. "obratlovčí" sekvence (TTAGGG)n je původní telomerickou DNA všech živočichů skupiny Bilateria. Objevili jsme též novou funkci telomer: v meiotickém dělení oocytů u samic motýlů se telomery významně podílejí na zabezpečení bezchybné segregace chromosomů.
Frydrychová, R., Marec, F. Repeated losses of TTAGG telomere repeats in evolution of beetles (Coleoptera). - Genetica 115: 179-187 (2002)
Frydrychová, R., Grossmann, P., Trubač, P., Vítková, M., Marec, F. Phylogenetic distribution of TTAGG telomeric repeats in insects. - Genome 47: 163-178 (2004)
Rego, A., Marec, F. Telomeric and interstitial telomeric sequences in holokinetic chromosomes of Lepidoptera: Telomeric DNA mediates association between postpachytene bivalents in achiasmatic meiosis of females. - Chromosome Research 11: 681-694 (2003)
Vítkova, M., Král, J., Traut, W., Zrzavý, J., Marec, F. The evolutionary origin of insect telomeric repeats, (TTAGG)n. Chromosome Research 13: iii-iii (2005) (in press)
5.7 Společný mechanismus udržování vysokého krevního tlaku u různých forem hypertenze
MUDr. Josef Zicha, DrSc.
Nerovnováha mezi vasokonstrikčními a vasodilatačními mechanismy je hlavní příčinou zvýšeného periferního cévního odporu u lidské i experimentální hypertenze. U zvířat s hypertenzí vyvolanou chronickou inhibicí tvorby oxidu dusnatého (NO) jsme zjistili, že vzestup krevního tlaku (TK) je dán zvýšením sympatické vasokonstrikce (1). Naopak vasodilatační kapacita není příliš omezena, neboť pokles tvorby NO v cévách je kompenzován posílením úlohy endoteliálního hyperpolarizačního faktoru (2). Zvýšený sympatický tonus je dán převahou vlivu angiotensinu II nad působením NO v prodloužené míše. Obdobný centrální mechanismus se uplatňuje i u solné hypertenze (3), neboť chronická antioxidační terapie N-acetylcysteinem snižuje TK překvapivým poklesem sympatické vasokonstrikce beze změn NO-dependentní vasodilatace. Totéž platí pro pokles TK a sympatické vasokonstrikce u spontánně hypertenzních potkanů, u nichž tvorba angiotensinu II byla potlačena chronickým podáváním captoprilu. U všech tří forem hypertenze je sympatická hyperaktivita provázena proporcionálním zvýšením vstupu Ca2+ do hladkého svalu cév cestou napěťově řízených Ca2+ kanálů (4). To ukazuje na společný mechanismus udržování vysokého TK u tří odlišných forem hypertenze.
1. Pecháňová O, Dobešová Z, Čejka J, Kuneš J, Zicha J: Vasoactive systems in L-NAME hypertension: the role of inducible NO synthase. J Hypertens 22: 167-173 (2004).
2. Kuneš J, Míková D, Dobešová Z, Bíbová J, Hampl V, Zicha J: Vasodilatory mechanisms in L-NAME hypertension. Hypertension 44: 566 (2004).
3. Kuneš J, Dobešová Z, Zicha J: Chronic N-acetylcysteine treatment prevents the development of salt hypertension in immature Dahl rats. J Hypertens 22 (Suppl. 2): S336 (2004).
4. Kuneš J, Hojná S, Kadlecová M, Dobešová Z, Rauchová H, Vokurková M, Loukotová J, Pecháňová O, Zicha J: Altered balance of vasoactive systems in experimental hypertension: the role of relative NO deficiency. Physiol Res 53 (Suppl. 1): S23-S34 (2004).
5.8 Membránové mikrodomény v hormonální signalizaci
Doc. RNDr Petr Svoboda, DrSc.
Při výzkumu buněčných a molekulárních mechanismů hormonální akce zprostředkované receptory spřaženými s G proteiny se ukazuje, že na povrchové buněčné membráně cílové buňky existují specifické mikrodomény, které koncentrují signální molekuly a zvyšují jejich funkční aktivitu (1). Při dlouhodobé stimulaci dochází naopak ke snížení množství příslušného G proteinu v membránových doménách (2). Snížení je specifické pro G protein stimulovaný příslušným receptorem. Množství G proteinu ve "většinové membránové fázi" která je plně solubilisována v neiontových detergentech se nemění (3-5). Membránové mikrodomény plní zřejmě podstatnou úlohu při internalisaci G proteinu, tj. při přenosu do nitra cílové buňky, která nastává při dlouhodobé stimulaci. Vzhledem k rozlišení dvou forem (poolů) G proteinů v buněčné membráně a přednostní lokalisaci caveolinu v membránových doménách lze předpokládat, že změny v lokalisaci G proteinů odrážejí změny v jejich funkční aktivitě. Vazba G proteinu na caveolin či jiné regulační bílkoviny může měnit jeho aktivitu a současně i distribuci mezi různými kompartmenty buněčné membrány. Caveolin působí inhibičně na aktivitu trimerních G proteinů.?
1. Bouřová, L., Koštrnová, A., Hejnová, L., Pesanová, Z., Moon, H.-Y., Novotný, J.: Graeme Milligan and Petr Svoboda. -opioid receptors exhibit high efficiency when activating trimeric G proteins in membrane domains. J. Neurochem. 85:34-49 (2003).
2. Moravcová, Z., Rudajev, V., Novotný, J., Černý, J., Matoušek, P.: Parenti, M., Milligan, G. and Svoboda, P. Long-term agonist stimulation of IP prostanoid receptor depletes the cognate Gs protein from membrane domains but does not affect the receptor level. Biochem. Biophys. Acta., 1691: 51-65(2004).
3. Matoušek, P., Hodný, Z., Švandová, I. and Svoboda P.: Different methods of membrane domains isolation result in similar 2-D distribution patterns of membrane domain proteins. Biochem. Cell Biol., 81: 365-372 (2003).
4. Matousek, P., Novotny, J. and Svoboda, P.: Resolution of Gs? and Gq?/G11? proteins in membrane domains by 2D electrophoresis. The effect of long term agonist stimulation. Physiological Res. 53, 295-303 (2004)
5. Matousek, P., Novotný, J., Rudajev, V. and Svoboda, P.: Prolonged agonist-stimulation does not alter the protein composition of membrane domains in spite of dramatic change in specific signaling cascade. Cell Biochem. Biophys., 42: 21-40 (2005).
5.9 Nový enzym cukerného metabolismu
J. Volc
Enzym pyranosadehydrogenasa (pyranosa:akceptor oxidoreduktasa) byl na základě našich dosavadních publikací a vyjádření nomenklaturní komise IUBMB kvalifikován jako protein s novou enzymovou aktivitou a bylo mu v tomto roce přiděleno EC 1.1.99.29 enzymové databáze. Byl isolován z myceliálních kultur hub rodu Agaricus (žampion) a charakterizován jako extracelulární FAD-glykoprotein uplatňující se při degradaci lignocelulosových substrátů. Nová kvalita proteinu byla nyní potvrzena i ze získaných nukleotidových sekvencí genů kódujících tento enzym (tři isoformy u A. meleagris). Pyranosadehydrogenasa se vyznačuje mimořádně širokou substrátovou tolerancí a variabilní regioselektivitou při C-2, C-3 popř. C-4 (di)oxidaci sacharidů (aldos a ketos v pyranosové formě, glykosidů a četných redukujících i neredukujících oligosacharidů) na příslušné di- a tri-karbonylové cukerné deriváty; jako elektronový akceptor slouží různé chinony:
(1) pyranosa + akceptor -> 2-dehydropyranosa (nebo 3-dehydropyranosa nebo 2,3-didehydropyranosa) + redukovaný akceptor
(2) pyranosid + akceptor -> 3-dehydropyranosid (nebo 3,4-didehydropyranosid) + redukovaný akceptor
Uvedený enzym poskytuje nový nástroj pro konverse sacharidů v cukerné chemii. Molekulárně genetické aspekty a potenciální biotechnologické aplikace (např. izomerace typu laktosa -> laktulosa) jsou zkoumány ve spolupráci s Universität für Bodenkultur Wien.
Nový typ enzymové katalýzy představují 3,4-dioxidace aromatických glykosidů ( -D-glucopyranosidů a -D-xylopyranosidů) na odpovídající trikarbonylové sacharidy, identifikované jako nové sloučeniny.
Volc J., Kubátová E., Wood D., Daniel G. (1997) Pyranose 2-dehydrogenase, a novel sugar oxidoreductase from the basidiomycete fungus Agaricus bisporus. Arch. Microbiol. 167: 119-125.
Volc J., Sedmera P., Halada P., Přikrylová V., Daniel G. (1998) C-2 and C-3 oxidation of D-Glc, and C-2 oxidation of D-Gal by pyranose dehydrogenase from Agaricus bisporus. Carbohydr. Res. 310: 151-156.
Volc J., Sedmera P., Halada P., Přikrylová V., Haltrich D. (2000) Double oxidation of D-xylose to Dglycero-pentos-2,3-diulose (2,3-diketo-D-xylose) by pyranose dehydrogenase from the mushroom Agaricus bisporus. Carbohydr. Res. 329: 219-225.
Volc J., Kubátová E., Daniel G., Sedmera P., Haltrich D. (2001) Screening of basidiomycete fungi for the quinone-dependent sugar C-2/C-3 oxidoreductase, pyranose dehydrogenase, and properties of the enzyme from Macrolepiota rhacodes. Arch. Microbiol. 176: 178-186.
Volc J., Sedmera P., Halada P., Daniel G., Přikrylová V., Haltrich D. (2002) C-3 oxidation of non-reducing sugars by a fungal pyranose dehydrogenase: spectral characterization. J. Mol. Catal. B: Enzymatic 17: 91-100.
Volc J., Sedmera P., Kujawa M., Halada P., Kubátová E., Haltrich D.(2004) Conversion of lactose to ?-D-galactopyranosyl-(1?4)-D-arabino-hexos-2-ulose (2-dehydro-lactose) and lactobiono-1,5-lactone by fungal pyranose dehydrogenase, J. Mol. Catal. 30 (3-4): 177-184.
Sedmera P., Halada P., Peterbauer C., Volc J. (2004) A new enzyme catalysis: 3,4-dioxidation of some aryl ?-D-glycopyranosides by fungal pyranose dehydrogenase. Tetrahedron Lett., 45 (47): 8677-8680 (IF 2.326)
5.10 Taxonomie námele
Claviceps fusiformis popsaná v r. 1967 působí námelové onemocnění v polopouštních oblastech Afriky a Indie na drobnozrnné obilnině Pennisetum glaucum (pearl millet, bajra) a travách rodu Cenchrus. Toxikózy působené tímto patogenem byly popsány zejména v Indii.
Výrazným morfologickým znakem C.fusifomis jsou vřetenovité až srpkovité konidie. C.fusiformis spontánně produkuje klavinové alkaloidy v laboratorních kulturách. Další druh se srpkovitými, avšak menšími spórami byl popsán jako australský endemit v r. 1942, pod názvem Claviceps hirtella parazitující na travách Cenchrus, Urochloa, Paspalidium a Eriochloa. Toxikózy způsobené tímto druhem nebyly nikdy pozorovány.
Od roku 1997 byla pozorována námelová onemocnění penniseta v Mexiku a Texasu, s předpokladem zavlečení C. fusiformis z Afriky. Provedli jsme proto srovnání afrických izolátů s izoláty z dvou texaských lokalit, a druhem C. hirtella pomocí morfologie konidií, produkce alkaloidů, RAPD a sekvencí rDNA.
RAPD s primerem 206 ukázalo shodu mezi Claviceps hirtella a africkými a texaskými isoláty C. fusiformis, prokazující, že tyto izoláty představují populace téhož druhu.
Rozdíly v morfologii konidií, výši produkce alkaloidů a hostitelském spektru mezi izoláty nasvědčují tomu, že se jedná o odděleně se vyvíjející populace téhož druhu. Podle pravidla přednosti staršího názvu se jedná o druh C. hirtella.
5.11 2,3-Dehydrosilybin - nová látka v terapii lupénky a dermatitid
V. Křen, R. Gažák, P. Sedmera (MBÚ); D. Walterová, V. Šimánek, J. Psotová (LF UP Olomouc)
Silymarin a jeho součást silybin jsou izolovány ze semen bodláku ostropestřec mariánský.
R. Gažák, A. Svobodová, J. Psotová, P. Sedmera, V. Přikrylová, D. Walterová and V. Křen Oxidised Derivatives of Silybin and their Antiradical and Antioxidant Activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry 12, 5677 - 5687 (2004).
N. Škottová, J. Ulrichová, V. Křen, J. Urbaníková, V. Šimánek: Flavonoidy silymarinu a polynenasycené mastné kyseliny rybízového oleje jako nutraceutikum v prevenci chronických onemocnění. Praktický lékař 83, 444-450 (2003).
Šimánek V., Walterová D., Vičar J., Urbaníková J., Křen V., Modrianský M., Škottová N., Ulrichová J.: "Silymarin", extract from the milk thistle (Silybum marianum) - medicine or a nutraceutics? Česká a Slovenská Farmacie 50, 66-69 (2001).
5.12 2,3-extradiolové štěpení L-DOPA je následováno intramolekulární cyklizací štěpného produktu
Jitka Novotná1, Aleš Honzátko1, Petr Bednář2, Jan Kopecký1, Jiří Janata1 a Jaroslav Spížek1
1 Institute of Microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, Vídeňská 1083, Praha, Czech Republic
2 Faculty of Science, Palacky University, Olomouc, Czech Republic
Linkomycin, a zvláště jeho semisyntetický derivát klindamycin, patří mezi klinicky významná antibiotika, avšak znalosti o jeho biosyntéze jsou spíše útržkovité. Molekula linkomycinu vzniká kondenzací subjednotky odvozené od cukrů (methylthiolinkosamid) a subjednotky odvozené od aminokyselin (propylprolin) s následnou modifikací. Ačkoli základní schéma biosyntézy bylo navrženo v roce 1984, v aminokyselinové větvi dráhy byl dosud identifikován pouze jediný intermediát, v cukerné žádný, což komplikuje přiřazování funkcí jednotlivým genům osekvenovaného linkomycinového biosyntetického shluku.
Účast proteinů LmbB1 a LmbB2 v počátečních krocích aminokyselinové větve biosyntézy linkomycinu byla předpokládána už dříve (1). V roce 2004 byly v naší laboratoři prokázány společně geny, proteiny a intermediáty prvních dvou reakcí. Proteiny LmbB1 a LmbB2, které nevykazují významnou podobnost k žádné ze známých proteinových rodin, byly exprimovány v E.coli a purifikovány v aktivní formě. Vyvinutí metody pro izolaci a analýzu reakčního produktu proteinu LmbB1 umožnilo potvrzení jeho předpokládané struktury (kyselina 4-(3-karboxy-3-oxo-propenyl)-2,3-dihydro-1H-pyrolo-2-carboxylová). Reakční produkt proteinu LmbB2, DOPA, byl identifikován porovnáním se standardem. Protein LmbB2 byl identifikován jako tyrosin hydroxylasa, protein LmbB1 jako DOPA 2,3-extradiol dioxygenáza (1) štěpící aromatický kruh za vzniku meziproduktu 2,3-secodopa, který podle původního předpokladu cyklizuje spontánně na finální produkt reakce. Porovnání biosyntetických drah linkomycinu, muscaflavinu a kyseliny stizolobinové, které zahrnují 2,3-extradiolové štěpení aromatického kruhu DOPA za tvorby různých produktů následné intramolekulární cyklizace, však naznačuje účast příslušných dioxygenáz v cyklizaci.
1) Neusser D., Schmidt, H., Spížek, J., Novotná , J., Peschke, U., Kaschabeck, S., Tichý, P. and Piepersberg, W. (1998) The genes lmbB1 and lmbB2 of Streptomyces lincolnensis encode enzymes involved in the conversion of L-tyrosine to propylproline dutiny the biosynthesis of the antibiotic lincomycin. A. Arch. Microbiol. 169, 322-332.
2) Novotná J., Honzátko A., Bednář P., Kopecký J., Janata J. and Spížek J. (2004) L-2,3-dihydroxyphenyl alanine-extradiol clevage is followed by intramolecular cyclization in lincomycin biosynthesis. Eur. J. Biochem. 271, 1-6
5.13 ANALÝZA GENOMU PŠENICE POMOCÍ TŘÍDĚNÝCH CHROMOZOMŮ
Jaroslav Doležel a kolektiv
Většina dědičné informace rostlin i živočichů je uložena v buněčném jádře ve formě chromozomů. Je zajímavé, že množství jaderné DNA, která tuto informaci nese, neodpovídá složitosti organismu. Zatímco jedna úplná kopie této informace (jaderný genom) je u člověka představována asi třemi miliardami párů bází DNA, genom mnoha rostlin je podstatně větší. Tak je tomu i u nejdůležitější zemědělské plodiny, pšenice obecné, jejíž genom představuje sedmnáct miliard párů bází. Analýza tak obrovského genomu je nesmírně obtížná a nákladná nejen vzhledem k jeho velikosti, ale také proto, že vznikl postupným křížením tří planých druhů trav s podobnými genomy, označovanými jako A, B a D.
S cílem tuto analýzu zjednodušit jsme vypracovali původní metodu umožňující izolovat malé a definované části genomu pšenice. Metoda je založena na přípravě suspenzí chromozomů, které jsou pomocí laserové průtokové cytometrie velkou rychlostí analyzovány a klasifikovány podle obsahu DNA. Současně s analýzou je možné vybraný typ chromozomu oddělovat od ostatních a získávat čisté frakce jednotlivých typů chromozomů nebo jejich ramen. Vzhledem k tomu, že chromozómy představují pouze zlomek celého genomu pšenice, využití jejich DNA umožňuje zásadní zjednodušení jeho analýzy.
V návaznosti na tento výsledek jsme zjistili, že DNA tříděných chromozomů je intaktní a měla by tedy být vhodná pro konstrukci knihoven DNA. Tyto knihovny jsou tvořeny souborem fragmentů DNA o velikosti asi sto tisíc párů bází, které reprezentují celý genom a jsou klíčovým materiálem pro sekvenování a izolaci genů. Úspěšná konstrukce tří knihoven DNA z tříděných chromozomů pšenice znamenala nejen potvrzení této hypotézy, ale především získání unikátních materiálů pro genomiku pšenice. V současné době jsou knihovny využívány při mapování genomu a studiu jeho evoluce a pro izolaci zemědělsky významných genů.
Obr. Srovnání velikosti jaderného genomu (1C) modelové rostliny huseníčku (Arabidopsis thaliana), který již byl téměř celý sekvenován, a genomu pšenice obecné, který je tvořen třemi subgenomy (A, B a D) po sedmi chromozómech (A).
DNA jednotlivých tříděných chromozómů představuje pouze 3 - 6% celého genomu pšenice (B). Ještě menší části genomu lze získat tříděním ramen chromozómů, jejichž velikost se blíží velikosti genomu A. thaliana.
Janda J., Bartoš J., Šafář J., Kubaláková M., Valárik M., Číhalíková J., Šimková H., Caboche M., Sourdille P., Bernard M., Chalhoub B., Doležel J.: Construction of a subgenomic BAC library specific for chromosomes 1D, 4D and 6D of hexaploid wheat. - Theor. Appl. Genet. 109: 1337-1345, 2004.
Kubaláková M., Vrána J., Číhalíková J., Šimková H., Doležel J.: Flow karyotyping and chromosome sorting in bread wheat (Triticum aestivum L.). - Theor. Appl. Genet. 104: 1362-1372, 2002.
Šafář J., Bartoš J., Janda J., Bellec A., Kubaláková M., Valárik M., Pateyron S., Weiserová J., Tušková R., Číhalíková J., Vrána J., Šimková H., Faivre-Rampant P., Sourdille P., Caboche M., Bernard M., Doležel J., Chalhoub B.: Dissecting large and complex genomes: flow sorting and BAC cloning of individual chromosomes from bread wheat. - Plant J. 39: 960-968, 2004.
*Spolupráce s Dr. Boulos Chalhoub (Unité de Recherches en Génomique Végétale, Évry, France)
5.14 Reparace dvojvláknových zlomů DNA v rostlinách
Karel J. Angelis a kol.
Dvojvláknové zlomy DNA jsou genotoxické poškození neslučitelné s normální funkcí genomu jakéhokoli organismu. K jejich odstranění se vyvinula řada reparačních drah, jejichž preference se liší podle organismu. Zatímco u prokaryot a nižších eukaryot převažuje homologní rekombinace (HR), u vyšších eukaryot včetně rostlin se předpokládá reparace mechanismem nehomologního spojování konců (NHEJ). Možnost změny preference reparace dvojvláknových zlomů ve prospěch HR u vyšších rostlin by měla zásadní biotechnologický význam pro cílenou modifikaci genů (tzv. gene targeting).
Proto je reparace dvojvláknových zlomů genomové DNA v naší laboratoři dlouhodobě analyzována u řady mutant huseníčku Arabidopsis a mechu Physcomitella patents pomocí tzv. metody komet. Kinetika reparace dvojvláknových zlomů indukovaných radiomimetikem Bleomycinem (Obr. 1) ukazuje u Arabidopsis na účast více mechanismů. V úvodní velmi rychlé fázi je více než 70 % zlomů opraveno během prvních 10 minut a na rychlost nemá vliv mutace v HR ani NHEJ. Tato rychlá fáze reparace dvojvláknových zlomů chybí u mechu Physcomitella patents, který oproti Arabidopsis téměř výlučně reparuje zlomy mechanismem HR (viz Obr. 1). Z našich dat proto vyplývá, že u Arabidopsis (a tabáku) musí existovat další mechanismus reparace dvojvláknových zlomů nezávislý na HR a NHEJ, který je zodpovědný za reparaci většiny zlomů. Tento mechanismus je pravděpodobně totožný s tím, který reparuje DSB během prvních hodin klíčení. Obr. 1
Závěrem lze shrnout, že vyšší rostliny reparují většinu dvojvláknových zlomů v genomu způsobem, který je nezávislý na dosud molekulárně prostudovaných mechanismech HR a NHEJ. V případě mechu Physcomitrella patents je potřeba nejprve prokázat, zda reparace dvojvláknových zlomů pouze pomocí HR není důsledkem haploidního vývojového stádia, ve kterém se všechny pokusy dělají.
Angelis K.J., Dušínská M., Collins A.R.: Single cell gel electrophoresis; detection of DNA damage at different levels of sensitivity. Electrophoresis 20: 2133-2138, 1999.
Heitzeberg F., Chen I.-P., Hartung F., Orel N., Angelis K.J., Puchta H.: The Rad9 and Rad17 homologues of Arabidopsis are Involved in the regulation of DNA damage repair and homologous recombination. Plant J. 38:954-968, 2004.
Takeda S., Tadele Z., Hofmann I., Angelis K.J., Kaya H., Araki T., Mengiste T., Scheid O.M., Probst A.V., Shibahara K., Scheel D., Paszkowski J.: BRU1, a novel link between genetic/epigenetic inheritance and meristem development in Arabidopsis. Genes & Development 18: 782-793, 2004.
Ve spolupráci s Prof. Holgerem Puchtou, Univ. Karlsruhe, SRN; Dr. Charlesem Whitem, CNRS-Biomove, Aubiére, Francie a Prof. Jerzym Paszkowskim, Univ. Genéve, Švýcarsko.
5.15 Kyselina fosfatidová (PA) produkovaná fosfolipázami D (PLD) se účastní regulace buněčné expanse rostlin
Viktor Žárský et. al.
Pro hledání odpovědí na ekologické a sociální problémy, které dnes před námi stojí, potřebujeme mezi jiným rozumět také tomu, jak rostliny řídí svůj růst a vývoj. Přes značný stupeň zachování společných buněčných procesů rostliny během evoluce získaly také specifický soubor regulátorů různých metabolických a morfogenních drah. Přisedlost rostlin spojená s evolucí rozvinuté dynamiky buněčných stěn je spojena s rostlinně specifickými regulátory buněčné expanze. Zjistili jsme, že mezi ně patří také nadrodina rostlinných PLD, které produkují v membráně PA jako signální molekulu.
Pomocí bioinformatických databází a programů jsme provedli důkladnou srovnávací analýzu rodiny PLD u eukaryot a při tom jsme odhalili nebývalou evoluční dynamiku rodiny PLD u rostlin. U Arabidopsis a podobně i u dalších rostlinných druhů existují dvě velké skupiny PLD - dvoučlenná rodina PLD příbuzných živočišným PLD a dalších deset isoenzymů specifických pro rostliny (Eliáš et al. 2002, Potocký nepublikováno). Regulační závislost různých typů PLD na lipidech, fosfoinositidech a vápníku umožňuje jemnou regulaci buněčných procesů v rostlinách v závislosti na kontextu. Na modelovém systému pylových láček tabáku pěstovaných in vitro jsme prokázali, že PA produkovaná aktivitou PLD se přímo podílí na regulaci polarizované buněčné expanze (Potocký et al. 2003). Rozlišení funkce specifických isoenzymů PLD nám umožnilo klonování pylových PLD (Potocký et al. 2004). Naše výsledky podporují předpokládanou účast specifických PLD v regulaci cytoskeletu.
Eliáš M., Potocký M., Cvrčková F., Žárský V.: Molecular diversity of phospholipase D in angiosperms. BMC Genomics 3: 2, 2002.
Potocký M., Eliáš M., Profotová B., Novotná Z., Valentová O., Žárský V.: Phosphatidic acid produced by phospholipase D is required for tobacco pollen tube growth. Planta 217: 122-130, 2003.
Potocký M., Bezvoda R., Synek L., Valentová O., Žárský V.: Multiple Phospholipase D Isoforms Are Involved In Regulation Of Polar Growth In Tobacco Pollen Tubes. 14th Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology, August 23-27 2004, Cracow, Poland. (poster and award lecture)
Tento výzkum probíhá ve spolupráci s laboratoří prof. Olgy Valentové na VŠCHT v Praze.
5.16 Aktin a myosin I se podílejí na transkripci genu
Zásadní úlohy aktinu a myosinu v buněčném a nitrobuněčném pohybu jsou dlouhou dobu známy. Naše nedávné výsledky však navrhly nové zásadní funkce pro aktin a myosin v kritických krocích při čtení genetické informace v buněčném jádře. Zkoumali jsme úlohu aktinu a jaderného myosinu I (NMI) v transkripci genů pro ribosomální RNA (rRNA). Bylo zjištěno, že oba proteiny jsou asociovány s rDNA a jsou nezbytné pro transkripci pomocí RNA polymerázy I (Pol I). Mikroinjekce protilátek proti aktinu či myosinu stejně jako specifické odstranění NMI prostřednictvím siRNA technologie snižovaly Pol I transkripci in vivo. Naopak, zvýšení exprese NMI v buňkách stimulovalo syntézu rRNA. Rekombinantní NMI aktivoval Pol I transkripci in vitro a protilátky proti NMI a aktinu inhibovaly transkripci Pol I na "nahé" DNA i na chromatinovém templátu. Aktin asocioval přímo s Pol I, kdežto NMI se k Pol I váže prostřednictvím transkripčně-iniciačního faktoru TIF-IA. Vazba k Pol I vyžaduje fosforylaci TIF-IA na Ser 649 pomocí RSK kinázy, což naznačuje úlohu NMI v růstově-dependentní regulaci syntézy rRNA (1). Dále jsme prokázali, že beta-aktin je zásadní pro transkripci pomocí RNA polymerázy II, která přepisuje většinu genů (Pol II), neboť protilátky proti aktinu zastavují transkripci in vivo a in vitro. Chromatinové imunoprecipitace u aktivovatelných genů ukázaly, že aktin je při aktivaci rekrutován do promotorové oblasti genu. Další výsledky prokázaly, že aktin a Pol II kolokalizují in vivo a také se nalézají ve stejných frakcích během purifikace. V transkripčních esejích in vitro bylo zjištěno, že protilátky proti aktinu zastavují transkripci, kdežto přidání purifikovaného beta-aktinu stimulovalo Pol II transkripci. Pokusy testující vazbu aktinu na DNA určily aktin v preiniciačních komplexech, které jsou předpokladem pro aktivaci transkripce. Výsledky tedy určily zásadní funkci beta-aktinu v iniciaci transkripce pomocí Pol II (2).
Philimonenko VV, Zhao J, Iben S, Dingova H, Kysela K, Kahle M, Zentgraf H, Hofmann WA, de Lanerolle P, Hozak P, Grummt I. Nuclear actin and myosin I are required for RNA polymerase I transcription. Nature Cell Biol. 2004, 6:1165-72 IF= IF 20.268
Hofmann WA, Stojiljkovic L, Fuchsova B, Vargas GM, Mavrommatis E, Philimonenko V, Kysela K, Goodrich JA, Lessard JL, Hope TJ, Hozak P, de Lanerolle P. Actin is part of pre-initiation complexes and is necessary for transcription by RNA polymerase II. Nature Cell Biol. 2004, 6:1094-101 IF= IF 20.268
5.17 Difúzní parametry extracelulárního prostoru v mozku transgenních APP23 myší - model Alzheimerovy choroby.
Difúzní parametry extracelulárního prostoru se mění u mnoha patologických stavů a ovlivňují nejen synaptický přenos, ale i nesynaptický přenos informací v nervovém systému, který je založen na difúzi neuroaktivních látek. Ukládání amyloidních plaků, poškození neuronů a synaptického přenosu je hlavní příčinou demence u Alzheimerovy choroby. Studovali jsme úlohu nesnaptického přenosu, resp. difúzní parametry v mozkové kůře, u transgenních APP23 myší u nichž se vyskytují morfologické změny a funkční symptomy podobné příznakům Alzheimerovy choroby. Užitím metody sledování difúze iontů v mozku in vivo metodou iontově-selektivních mikroelektrod a užitím difúzně vážené magnetické resonance jsme prokázali změny objemové frakce (velikosti pórů) extracelulárního prostoru, aparentního difúzního koeficientu extracelulárně difundujícího tetrametylamonia (ADCTMA) a aparentního difúzního koeficientu vody (ADCW). Pokusy byly provedeny u dospělých a u starých APP23 myší (samců vs. samiček) a u stejně starých kontrolních zvířat. U dospělých APP23 myší nebyly hodnoty objemové frakce, ADCTMA ani ADCW statisticky významně odlišné od hodnot u stejně starých kontrolních myší. U starých kontrolních myší došlo k významnému poklesu objemové frakce extracelulárního prostoru, které bylo větší u samiček než u samců. ADCTMA zůstalo nezměněno. Oproti tomu u transgenních zvířat došlo ke zvětšení objemové frakce extracelulárního prostoru a také k poklesu ADCTMA. Tyto nálezy korelovaly se zhoršeným učením v Morrisově vodním bludišti u starých samiček a s množstvím amyloidních plaků, které bylo dvojnásobné u samiček než u samců.
Změněné difúzní vlastnosti extracelulárního prostoru ovlivňují nejen synaptický, ale i nesynaptický přenos informací a prostorovou paměť u starých transgenních APP23 samiček a lze proto předpokládat, že tyto změny ovlivňují kognitivní schopnosti i u pacientů s Alzheimerovou chorobou.
Syková E., Voříšek I., Antonova T., Mazel T., Meyer-Luehmann M., Jucker M., Hájek M., Ort M. and Bureš J. Changes in extracellular space size and geometry in APP23 transgenic mice - a model of Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102:479-84 IF= IF 10.272
Syková, E. (2004) Extrasynaptic volume transmission and diffusion parameters of the extracellular space. Neuroscience 2004, 129:861-76 IF= IF 3.601
Sykova, E. (2004) Diffusion properties of the brain in health and disease. Neurochem. Int. 2004, 45:453-66 IF= IF 3.261
5.18 Analýza mutací viroidu pstv vyvolaných teplotním šokem a biolistickou inokulací u potomstva viroidních termomutantů rajčete a řepky.
MATOUŠEK, J., ORCTOVÁ, L., STEGER, G., ŠKOPEK, J., MOORS, M., DĚDIČ, P., RIESNER, D.
Teplotní stres vede u rostlinných viroidů, významných patogenů parazitujících u rostlin, tvořených krátkou ribonukleovou kyselinou k vysoké frekvenci mutací. Vzniklí termomutanti jsou schopni se adaptovat na nové rostlinné druhy, kde tvoří nové populace. U viroidu vřetenovitosti bramborových hlíz jsme prokázali přizpůsobivost těchto molekul na některé rostliny z čeledi motýlokvětých, kde vznikaly zvláštní nové mutace. Po převodu do původního hostitele došlo k readaptaci. Práce prokazuje zásadní význam termomutací jako substrátu pro evoluční změny u těchto patogenů.
Matoušek, J., Orctová, L., Steger, G., Škopek, J., Moors, M., Dědič, P., Riesner, D.: Analysis of thermal stress-mediated PSTVd variation and biolistic inoculation of progeny of viroid "thermomutants" to tomato and Brassica species. - Virology 323: 9-23 (2004)
5.19 Objasnění genetické diverzity světové populace TuMV
TOMIMURA, K., ŠPAK, J., KATIS, N., JENNER, C.E., WALSH, J.A., GIBBS, A.J., OHSHIMA, K.
Virus mozaiky vodnice (Turnip mosaic virus - TuMV) je celosvětově pravděpodobně nejrozšířenější a nejvýznamnější virus infikující brukvovité rostliny. Je to vláknitý virus s RNA genomem dlouhým kolem 10 000 nukleotidů kódujícím 10 různých proteinů. Jeho evropské a západoasijské populace infikují převážně rostliny z rodu brukev (Brassica), východoasijské populace pak navíc i rostliny z rodu ředkev (Raphanus). Celkem bylo analyzováno 70 evropských a západoasijských izolátů, 72 východoasijských izolátů a 6 izolátů jiného původu. Sekvenování přibližně třetiny délky genomu všech izolátů a následující srovnání dat ukázalo, že východoasijská populace TuMV je mnohem méně divergována než evropská populace. Vyskytuje se v ní však jiný poměr nesynonymních a synonymních substitucí, což naznačuje, že se viry v této populaci vyvíjejí nezávisle na původní evropské populaci. Kromě toho se v obou populacích vyskytují izoláty, které vznikly rekombinací. Tento jev je u virů znám, ale na takovém souboru celosvětových vzorků ho nikdo dosud nezkoumal. Zajímavé je, že u evropských a západoasijských izolátů nejčastěji rekombinoval gen pro protein P1, který má funkci proteázy a ovlivňuje šíření viru v rostlině, zatímco u východoasijských izolátů se rekombinace našly rozložené po celém genomu. Předpokládáme, že přinejmenším některé rekombinace v genu P1 a v genu VPg přináší virům evoluční výhodu, protože takovéto viry v populacích přežívají.
Mapa míst rekombinací na genomu TuMV.
Tomimura, K., Špak, J., Katis, N., Jenner, C.E., Walsh, J.A., Gibbs, A.J., Ohshima, K.: Comparison of the genetic structure of populations of Turnip mosaic virus in west and east Eurasia. - Virology 300: 408-423 (2004).
5.20 Negativní regulace funkcí žírných buněk a přenosu signálů v nich adaptorovým proteinem LAB/NTAL
Volná P, Lebduška P, Dráberová L, Šímová Š, Heneberg P, Boubelík M, Bugajev V , Malissen B, Wilson BS, Hořejší V, Malissen M, Dráber P. Negative regulation of mast cell signaling and function by the adaptor LAB/NTAL. J Exp Med. 200:1001-13, 2004
Aktivace žírných buněk vede k uvolnění jejich sekrečních komponent a tím k rozvoji zánětlivých a alergických stavů. Prvním biochemicky definovaným krokem v tomto procesu je tyrosinová fosforylace subjednotek IgE receptoru a dalších substrátů, včetně adaptorového proteinu LAT. Nedávno jsme zjistili, že žírné buňky exprimují nový transmembránový adaptorový protein NTAL, který je strukturálně podobný LAT a je rovněž rychle fosforylován u aktivovaných buněk. Abychom určili úlohu NTAL ve fyziologii žírných buněk, připravili jsme myši defektní v expresi NTAL, LAT nebo obou proteinů a analyzovali jejich vlastnosti. Zjistili jsme, že v podmínkách in vitro je sekrece u aktivovaných žírných buněk v následujícím pořadí: NTAL-deficientní > buňky divokého typu > LAT-deficientní > NTAL/LAT-deficientní. Dále jsme zjistili, že u aktivovaných NTAL-deficientních buněk dochází k zvýšené fosforylaci několika proteinů. Aktivita fosfatidylinositol-3 kinázy a fosfolipázy C? byla rovněž zvýšena. Tyto změny vedly ke zvýšené hladině volného cytoplasmatického vápníku a sekreční odpovědi. Elektron-mikroskopické analýzy ukázaly, že NTAL je lokalizován v unikátních membránových mikrodoménách, které jsou odlišné od LAT mikrodomén. V souhrnu naše výsledky dokumentují, že NTAL je významný negativní regulátor IgE receptorové aktivace žírných buněk. Předpokládáme, že snížená exprese nebo mutace adaptorového proteinu NTAL může přispět k zvýšené citlivosti organismu k alergenům.
5.21 Vazba nového fenylnorstatinového inhibitoru k HIV-1 protease: Geometrie, protonace a interakce ve vazebných kapsách ve struktuře s atomovým rozlišením
Brynda J, Rezacova P, Fabry M, Horejsi M, Stouracova R, Sedlacek J, Soucek M, Hradilek M, Lepsik M, Konvalinka J. A phenylnorstatine inhibitor binding to HIV-1 protease: geometry, protonation, and subsite-pocket interactions analyzed at atomic resolution. J Med Chem. 2004 Apr 8;47(8):2030-6. Brynda J, Rezacova P, Fabry M, Horejsi M, Stouracova R, Soucek M, Hradilek M , Konvalinka J, Sedlacek J. Inhibitor binding at the protein interface in crystals of a HIV-1 protease complex. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60:1943-8, 2004.
S rozlišením 1.03 ? byla vyřešena rentgenová struktura komplexu HIV-1 proteasy (PR) s novým fenylnorstatinovým inhibitorem Z Pns Phe Glu Glu NH2 ; toto rozlišení je nejvyšší mezi dosud vyřešenými strukturami HIV PR komplexů. Struktura vykazuje zajímavou geometrii vodíkových vazeb katalytických aspartátů. Vysoké rozlišení umožňuje určení donorových/akceptorových vztahů u těchto vodíkových vazeb a nalezení protonu sdíleného dvěma katalytickými aspartáty (Obrázek).
Hranice rozlišení je, obecně řečeno, určena stupněm uspořádání molekul v krystalu - uspořádanější krystal poskytne vyšší rozlišení. Ve vyřešené komplexní struktuře byla na rozhraní bílkovinných molekul nalezena druhá molekula inhibitoru a určené interakce protein:ligand:protein lze považovat za faktor přispívající k pevnosti krystalové mřížky i k vysoké praktické difrakční kvalitě krystalu.
5.22 Charakterizace kuřecích genů kódujících receptorové molekuly pro ptačí sarkomové a leukózové viry podskupiny A a C.
Elleder, D., Melder, D.C., Trejbalova, K., Svoboda, J., Federspiel, M.J.: Two different molecular defects in the Tva receptor gene explain the resistance of two tvar lines of chickens to infection by subgroup A avian sarcoma and leukosis viruses. J. Virol. 78: 13489-13500, 2004.
Elleder. D., Plachý, J., Hejnar, J., Geryk, J.,Svoboda, J. : Close linkage of genes encoding receptors for subgroups A and C of avian sarcoma/leukosis virus on chicken chromosome 28. Anim. Genet. 35: 176-181, 2004.
Retrovirové receptory jsou specifické proteiny na povrchu buňky, umožňující vstup viru do buňky. Ptačí sarkomové a leukózové viry (ASLV) se vyznačují velkou různorodostí obalových glykoproteinů, která však odpovídá receptorovým molekulám přítomným na buňkách různých hostitelů. Na základě této různorodosti jsou ASLV klasifikovány do různých podskupin (A-F). Dosud byly klonovány a charakterizovány receptory virů podskupin A,B,D a E. Protože receptorový gen (tvas) pro ptačí retroviry podskupiny A (ASLV-A) byl plně charakterizován pouze u křepelek, klonovali jsme kuřecí tvas gen z kuřat vnímavých k infekci. Nalezli jsme, že kuřecí receptorový gen je překládán ze dvou alternativně sestřižených mRNA, stejně jako u křepelek. Kromě toho jsme identifikovali defekty v receptorových genech, klonovaných ze dvou různých linií kuřat, rezistentních k infekci viry podskupiny A. U linie C jsme v genu tvar nalezli substituci jednoho páru bazí, která odpovídá za silnou redukci vazebné afinity receptorové molekuly k virovému obalovému glykoproteinu. U linie 72 gen tvar2 obsahuje inserci 4 párů bazí v prvním exonu, která mění čtecí rámec a brání syntéze funkční receptorové molekuly. Protože receptor pro viry podskupiny C (ASLV-C) nebyl dosposud identifikován, pokusili jsme se o určení pozice tvc genu na kuřecím chromosomu. Nalezli jsme, že tvc se nachází na chromozomu 28 a je v úzké genetické vazbě s tva.
5.23 Možnosti přirozené náhrady trvalých zubů?
Možnost přirozené náhrady trvalých zubů představuje atraktivní výzvu pro výzkum v oblasti molekulární stomatologie. Zubní základy se vytvářejí během embryonálního vývoje na základě vzájemných interakcí a mezibuněčných signalizací vrstev epitelu a mezenchymu. Pochopení této buněčné komunikace otevírá cestu k cíleným modulacím odontogeneze. Procesy proliferace a apoptózy představují komplementární děje podílející se na morfogenetickém tváření zubních základů. Rozmístění apoptotických buněk během vývoje zubních základů, které bylo detekováno v naší laboratoři s využitím experimentálního modelu hraboše mokřadního, vykazuje specifické uspořádání. Toto ukazuje na řadu možných rolí apoptotického procesu při modelování tvaru a velikosti zubu, stejně jako jeho přesné umístění v čelisti. Dosud však není objasněno, "jak a proč" k dentální apoptóze dochází. Sledování kandidátních molekul apoptotické kaskády, systému zprostředkovaného buněčnými receptory ukázalo na možné uplatnění signálního komplexu FasR-FasL-FADD v průběhu dentální apoptózy. Pro funkční průkaz sledovaných molekul bude využito technik zubních explantátů kultivovaných ex vivo. Tyto moderní metody umožňují jednak modifikace signální procesů na molekulární úrovni v rámci intaktní tkáně či orgánu, ale také přístupy s využitím kmenových buněk.
Matalová E., Tucker A.S., Sharpe P.T. (2004): Death in the life of a tooth. J Dent Res 83: 11 - 16
Matalová E., Witter K., Míšek I. (2004): Apoptosis distribution in the first molar tooth germ of the field vole (Microtus agrestis). Tissue and Cell 36: 361-367
Matalová E., Tucker A.S., Míšek I. (2004): Apoptosis-related factors (Fas receptor, Fas ligand, FADD) in early tooth development of the field vole (Microtus agrestis). Arch Oral Biol (in press)
5.24 Anaerobní houby u přežvýkavců
Zažívací trakt přežvýkavců a některých býložravců osídlují zcela neobvyklé houby náležející k třídě Chytridiomyceta. Tyto houby jsou velmi výjimečné zejména ze dvou důvodů: jsou striktně anaerobní a neobsahují mitochondrie. Jsou to jediné anaerobní organismy, kterým jako energetické centrum slouží hydrogenosomy. Pozoruhodná je také jejich produkce hydrolytických enzymů, neboť syntetizují jedny z nejaktivnšjších celuláz a hemiceluláz. Naše pracoviště se zabývá anaerobními houbami z bachoru přežvýkavců z hlediska jejich taxonomie a fylogeneze. Tradiční klasifikace na základě morfologie nedokáže přesně rozlišit mezi jednotlivými rody anaerobních hub. Metody molekulární biologie nezávislé na morfologických znacích přinášejí nové poznatky o příbuzenských vztazích mezi rody těchto anaerobních hub. Naše laboratoř se specializuje na polycentrické anaerobní houby rodů Anaeromyces a Orpinomyces a pomocí sekvenční analýzy různých úseků ribosomální DNA se podařilo prokázat, že i přes velkou morfologickou podobnost se jedná o dvě oddělené, monofyletické skupiny hub. Rovněž studium účinlů hydrolázových aktivit bachorových hub jejich chitinolytickým komplexem poskytuje další význačný soubor znaků pro další systematické studium těchto unikátních mikroorganismů, které mohou mít nepochybně velký biotechnologický význam.
Fliegerová K., Hodrová B., Voigt K (2004) Classical and molecular approaches to as a powerful tool for the characterization of rumen polycentric fungi. Folia Microbiologica 49 (2): 157- 164
Fliegerová K., Hodrová K., Bartoňová H., Štrosová L. (2004) Chitinolytic activity of the anaerobic polycentric fungus Anaeromyces mucronatus. Reproduction, Nutrition, Development 44: S77
Kontaktní osoba ing. J. Kopečný, DrSc.; tel. 267090502, e-mail: kopecnyj@iapg.cas.cz
Mycelium anaerobní houby rodu Anaeromyces mucronatus (světelný mikroskop, zvětšeno 240x)
5.25 Určení genů zodpovědných za vznik melanomových nádorů u laboratorních prasat MeLiM
U miniaturních prasat linie MeLiM byla provedena částečná analýza genomu s cílem nalézt u tohoto zvířecího modelu geny zodpovědné za vývoj maligního melanomu, jednoho z nejzhoubnějších nádorů vůbec. Postižená zvířata linie MeLiM byla křížena vzájemně a se zdravými prasaty plemena Duroc, což dalo vznik čistým rodinám MeLiM, dceřinným a zpětným křížencům. Jejich DNA byla analyzována pomocí mikrosatelitních znaků a zároveň byl sledován výskyt melanomů. Byly identifikovány čtyři chromozómové oblasti oblasti na prasečím chromosomu č. 1, 2, 7 a 8, kde pravděpodobně leží geny podílející se na vzniku melanomu. Pátá oblast byla odhalena na chromozómu č.6 v blízkosti genu pro melanokortinový receptor (MC1R). Tři oblasti na PC 1, 6 a 7 mají odpovídají protějšky na lidských chromozómech č. 9p, 16q a 6p, které obsahují místa potenciálně participující na vzniku melanomu.
Geffrotin C., Crechet F., Le Roy P., Le Chalony C., Leplat J.-J., Iannuccelli N., Barbosa A., Renard C., Gruand J., Milan D., Horak V., Tricaud Y., Bouet S., Franck M., Frelat G., Vincent-Naulleau S. (2004) Identification of five chromosomal regions involved in predisposition to melanoma by genome-wide scan in the MeLiM swine model. Int. J. Cancer 110: 39-50
