5. Sekce biologických a lékařských věd
Seznam anotací:
- Ribozomální Kink-turn motiv v roli flexibilního molekulárního kloubu (BFÚ)
- "Vícebarevné" elektrochemické značení DNA komplexy oxidu osmičelého (BFÚ)
- Proliferativní efekty polycycklických aromatických uhlovodíků a jejich úloha v nádorové promoci (BFÚ)
- Obrácené repetice DNA jako molekulární přepínače genetické aktivity (BFÚ)
- Úloha δ izoformy protein kinázy C v kardioprotektivním působení chronické hypoxie (FGÚ)
- Na+/H+ antiportery nižších eukaryot (FGÚ)
- Mechanismy sekrece a excitability hypofyzárních buněk (FGÚ)
- Kompartmentalizace plasmatické membrány kvasinek (MBÚ)
- Hřebenové dendrimery obsahující Tn antigen modulují přirozené zabíjení a vyvolávají produkci specifických protilátek proti Tn (MBÚ)
- Exocyst u rostlin (ÚEB)
- Kyselina trichloroctová v lesním ekosystému (ÚEB)
- Úloha individuální vnímavosti a oprav DNA v mechanismech genových poškození a dopad na vznik nádorů (ÚEM)
- Biodegradovatelné polymerní makroporézní hydrogely pro terapii míšních lézí (ÚEM)
- HIC1 snižuje aktivitu signalizace Wnt prostřednictvím strhávání faktoru TCF 4 a β-kateninu do jaderných tělísek (ÚMG)
- Význam aktivity Aurory B a fosforylace histonu H3 v procesu kondenzace chromosomů během meiotického zrání prasečích ovocytů (ÚŽFG)
- Apoptóza v odontogenezi (ÚŽFG)
- DNA jako klíč k rekonstrukci klimatických změn (ÚŽFG)
5.1 Ribozomální Kink-turn motiv v roli flexibilniho molekularniho kloubu (B)
Systémy, které označujeme jako Kink-turn (K-turn) motivy, jsou asymetrické interní smyčky v molekulách RNA, jejichž charakteristickým rysem je ostrý ohyb v oblasti cukr-fosfátové páteře (obr.1a). K-turn motivy se nacházejí především v ribozomální RNA, a to převážně v oblastech, které hrají klíčovou roli při syntéze bílkovin. V Laboratoři struktury a dynamiky nukleových kyselin jsme provedli rozsáhlou počítačovou strukturně-dynamickou analýzu několika vybraných Kink-turn motivů, založenou na moderní metodice počítačových simulací s explicitním zahrnutím vody a iontů. Pomocí těchto metod se nám podařilo získat velmi cenné údaje o struktuře a dynamickém chování těchto struktur na atomární úrovni, a tak významně doplnit dostupné informace o molekulárních interakcích v ribozomech. Zjistili jsme, že K-turn motivy představují velmi flexibilní molekulární klouby, které se mohou významně podílet na regulaci vzájemných pohybů ribozomálních segmentů, ke kterým dochází při jednotlivých fázích proteosyntézy. Dále jsme zjistili, že K-turny jsou obklopeny unikátní sítí hydratačních míst, které se významně podílejí na konformačních změnách těchto struktur. Ukázali jsme, že zcela zásadní roli v dynamickém chování K-turnů hraje tzv. A-minor motiv (obr.1b). Rozdílné isoenergetické substavy A-minor motivu jsou pak přímo spojeny s přítomností či nepřítomností molekul vody v této oblasti.
Obrázek 1: a) prostorové uspořádání K-turn motivu, b) A-minor motiv
Rázga, F., Zacharias, M., Réblová, K., Koča, J., Šponer, J: RNA Kink-turns as molecular elbows: Hydration, cation binding, and large scale dynamics. - Structure 14: 825-835 (2006) >
5.2 "Vícebarevné" elektrochemické značení DNA komplexy oxidu osmičelého
Při elektrochemické detekci hybridizace DNA (o které se uvažuje jako o výhodné alternativě k současným technikám založeným na jiných detekčních principech, převážně optických) se často využívá značení oligonukleotidových signálních sond (reporter probes, RP) elektroaktivními skupinami. Komplexy oxidu osmičelého s terciárními aminy (Os,L) se kovalentně vážou na pyrimidinové (přednostně thyminové) zbytky a tvoří stabilní, elektrochemicky aktivní adukty. Navrhli jsme techniku elektrochemického "vícebarevného" kódování založenou na modifikaci RP značkami na bázi Os,L nesoucích různé dusíkaté ligandy (např. 2,2'-bipyridin, deriváty 1,10-fenantrolinu nebo N,N,N',N'-tetramethylethylendiamin). RP značené Os,L poskytují na uhlíkových elektrodách specifické voltametrické signály, jejichž potenciály se liší v závislosti na typu ligandu. Značky s dostatečně velkými rozdíly jejich redox potenciálů lze použít pro paralelní analýzu více cílových DNA pomocí tzv. "dvoupovrchové" elektrochemické metody (vlastní hybridizace se provede na povrchu magnetického nosiče a sondy rozpoznávající konkrétní nukleotidovou sekvenci jsou poté identifikovány a stanoveny elektrochemicky). Výhodou modifikace sond sestávajících z úseku komplementárního k dané cílové DNA a z koncového segmentu oligo(T) (na který jsou značky navázány) Os,L je fakt, že tento způsob značení nevyžaduje vybavení pro organickou syntézu a lze jej provést v jakékoli molekulárně biologické laboratoři. Navíc jsme poprvé ukázali, že tato technologie může být využita pro značení RP komplementárních k jakékoli cílové DNA, tedy i takové, která obsahuje purinové i pyrimidinové baze.
Obr.: Schematické znázornění hybridizace tří různých cílových DNA, zachycených na povrchu magnetické částice, s komplementárními signálními sondami označenými třemi různými komplexy oxidu osmičelého.
Fojta, M., Kostecka, P., Trefulka, M., Havran, L. and Palecek, E. (2007) "Multicolor" Electrochemical Labeling of DNA Hybridization Probes with Osmium Tetroxide Complexes Anal. Chem., 79 (v tisku - vyjde v únoru 2007; elektronicky publikováno 22.12.2006). >
5.3 Proliferativní efekty polycycklických aromatických uhlovodíků a jejich úloha v nádorové promoci
Polycyklické aromatické sloučeniny (PAU) patří mezi významné kontaminanty životního prostředí. Řada těchto sloučenin má prokázané karcinogenní účinky, které jsou připisovány především jejich schopnosti poškozovat DNA, nicméně o dalších mechanismech jejich účinku je známo jen velmi málo. Naše výsledky ukazují, že tyto látky mají také negenotoxické účinky vedoucí k narušení kontroly buněčné proliferace, což souvisí s aktivací receptoru pro aromatické uhlovodíky (AhR) (1-3). Ta vede ke zvýšené expresi proteinů kontrolujících průchod buněk S-fází buněčného cyklu, jako je např. cyklin A, a zvýšené aktivitě cyklin-dependentních kináz, především cdk2 (1). Pro přežití a proliferaci buněk ovlivněných PAU je rozhodující rovnováha mezi genotoxickými a negenotoxickými účinky těchto sloučenin (1, 3, 4). Náš výzkum má praktický význam pro poznání mechanismů účinku toxických látek kontaminujících životní prostředí a při analýze rizik, která tyto látky představují pro lidské zdraví.
Publikace:
1. Andrysík Z., Vondráček J., Machala M., Krčmář P., Švihálková-Šindlerová L., Kranz A., Weiss C., Faust D., Kozubík A., Dietrich C. (2007) The aryl hydrocarbon receptor-dependent deregulation of cell cycle control induced by polycyclic aromatic hydrocarbons in rat liver epithelial cells. Mutat. Res. 615(1-2): 87-97.
2. Švihálková-Šindlerová L., Machala M., Pěnčíková K., Marvanová S., Neča J., Krčmář P., Topinka J., Sevastyanova O., Kozubík A., Vondráček J. (2007) Dibenzoanthracenes and benzochrysenes elicit both genotoxic and nongenotoxic events in rat liver 'stem-like' cells. Toxicology in press
3. Vondráček J., Švihálková-Šindlerová L., Pěnčíková K., Krčmář P., Andrysík Z., Chramostová K., Marvanová S., Valovičová Z., Kozubík A., Gábelová A., Machala M. (2006) 7H-Dibenzo[c,g]carbazole and 5,9-dimethyldibenzo[c,g]carbazole exert multiple toxic events contributing to tumor promotion in rat liver epithelial 'stem-like' cells. Mutat. Res. 596(1-2): 43-56.
4. Andrysík Z., Machala M., Chramostová K., Hofmanová J., Kozubík A., Vondráček J. (2006) Activation of ERK1/2 and p38 by polycyclic aromatic hydrocarbons in rat liver epithelial cells is associated with induction of apoptosis. Toxicol. Appl. Pharmacol. 211(3): 198-208.
5.4 Obrácené repetice DNA jako molekulární přepínače genetické aktivity
V badatelské činnosti jsme se věnovali studiu vzájemných interakcí uměle vnášených genů do chromosomu (transgenů). Je známo, že transgenní lokusy mohou v buněčném jádře interagovat jak mezi sebou tak i s geny hostitelského organismu. Výsledkem těchto interakcí je obtížně predikovatelná exprese genu, která je důležitá pro praktické využíváni transgenní technologie v medicíně, zemědělství a biotechnologiích. Náš výzkum založený na klasickém Mendelově křížení rostlin přinesl poznatek, že pouze určitá epigenetická forma transgenu (epialela) má tu zajímavou schopnost vyhledat v buněčném jádře partnera a "na dálku" s ním komunikovat (viz. obrázek). Tato kompetentní epialela nazvaná "1" je transkripčně aktivní, zatímco její trankripčně neaktivní varianta nazvaná epialela "1E" se vyznačuje epigenetickou metylací promotoru (úsek genu, kde se zahajuje transkripce RNA) a jakýkoliv homologní lokus v jádře je pro ni neviditelný. Schopnost komunikace mezi homologními lokusy DNA, které se vyskytují na různých chromosomech, tedy souvisí s transkripční aktivitou alespoň jednoho z nich. Výsledky naznačují, že se nám podařilo identifikovat nový mechanismus regulace exprese mnohakopiových genových rodin, který je založen výhradně na struktuře DNA, její epigenetické modifikaci a transkripci. Přepokládáme, že elementy obsahující invertované repetice DNA mohou sloužit v složitém eukaryotním genomu jako molekulární přepínače genetické aktivity.
Obr. 1 - Model intergenové komunikace prostřednictvím "epigenetického relé"
Jádro nalevo nese epialelu transgenu označenou jako "1" (žlutý obdélník). Tato aktivně komunikuje s homologním transgenem "2" (znázorněno červenou barvou), který se nachází na jiném místě genomu. Výsledkem je umlčení exprese (funkčního projevu) transgenu "2". Jádro v pravé části obrázku nese transkripčně neaktivní variantu transgenu 1, kterou jsme nazvali jako epialela "1E" (zelený obdélník). Tato forma již nemá schopnost komunikovat s transgenem "2", který zůstává transkripčně aktivní. Fluoreskující modrá barva znamená přítomnost DNA.
Publikace:
Fojtová, M., Bleys, A., Bedřichová,B., Van Houdt, H., Krížova, K., Depicker, A., Kovařík, A. - The trans silencing capacity of invertedly repeated transgenes depends on their epigenetic state in tobacco. Nucleic Acids Res. 34: 2280-2293 (2006)
5.5 Úloha δ izoformy protein kinázy C v kardioprotektivním působení chronické hypoxie
František Kolář
Adaptace na chronickou hypoxii dlouhodobě zlepšuje odolnost srdečního svalu k akutnímu ischemicko-reperfuznímu poškození, avšak molekulární mechanizmus tohoto protektivního účinku je dosud nejasný. Zjistili jsme že, chronická intermitentní hypoxie zvyšuje expresi δ izoformy protein kinázy C (PKC) v myokardu potkana a způsobuje její redistribuci do membránových struktur, především do mitochondrií, zatímco na izoformu PKC-ε, která je považována za klíčovou pro krátkodobé formy protekce myokardu, nemá podstatný vliv (1). Podávání antioxidantu N-acetylcysteinu v průběhu adaptace zabránilo jak změnám v expresi a distribuci PKC-δ, tak rozvoji kardioprotektivního účinku (omezení rozsahu infarktu myokardu, vyvolaného okluzí věnčité tepny) (2). Akutní podání inhibitorů PKC, chelerythrinu či rottlerinu, který je selektivní k PKC-δ, potlačilo protektivní působení chronické hypoxie (1). Z výsledků vyplývá, že oxidativní stres, který doprovází chronickou intermitentní hypoxii, hraje významnou úlohu v indukci endogenního kardioprotektivního mechanizmu, ve kterém se zásadním způsobem uplatňuje PKC-δ, avšak nikoliv PKC-ε.
(1) Neckář J, Marková I, Novák F, Nováková O, Szárszoi O, Ošťádal B, Kolář F. Increased expression and altered subcellular distribution of PKC isoform ? in chronically hypoxic rat myocardium: involvement in cardioprotection. Am J Physiol Heart Circ Physiol 288:H1566-1572, 2005.
(2) Kolář F, Ježková J, Balková P, Břeh J, Neckář J, Novák F, Nováková O, Tomášová H, Srbová M, Ošťádal B, Wilhelm J, Herget J: Role of oxidative stress in PKC-? upregulation and cardioprotection induced by chronic intermittent hypoxia. Am J Physiol Heart Circ Physiol, v tisku (doi:10.1152/ajpheart.00689.2006).
5.6 Na+/H+ antiportery nižších eukaryot
Hana Sychrová
Proteiny transportující přes buněčné membrány kationty sodíku nebo draslíku proti protonům se nazývají antiportery, existují ve všech typech organismů a mají celou řadu důležitých fyziologických funkcí. Tyto proteiny jsou v membránách buněk speciálně poskládány a jejich chybná činnost ovlivňuje např. krevní tlak, funkci mozku nebo ledvin. Příprava mutantů modelového organismu S. cerevisiae postrádajících různé transportéry draselných a sodných kationtů nám umožnila pomocí heterologní exprese, nebo-li vnesením genů z jiných organismů do S. cerevisiae, charakterizovat substrátové specifity a buněčné funkce celé řady Na+,K+/H+ antiporterů z různých organismů. V některých druzích existuje v buněčné membráně pouze jeden antiporter pro všechny kationty alkalických kovů, zatímco v jiných druzích se v evoluci vyvinuly systémy dva lišící se substrátovou specifitou pro kationty draselné či sodné. Pomocí mutací jsme zjistili, že pro transportní aktivitu a vazbu sodných nebo draselných kationtů proteinem jsou velmi důležité jeho aminokyselinové zbytky s hydroxylovou skupinou, které se nacházejí v 5. transmembránové oblasti proteinu, (Ser 140, Thr 151) a také mezi druhy vysoce konzervovaný Pro145. Podrobné studie fyziologických funkcí modelového antiporteru ScNha1 prokázali, že kromě detoxifikace (export toxických kationtů Na+ a Li+ z buněk) je aktivita tohoto proteinu důležitá pro 1) zachování vnitrobuněčné optimální koncentrace draselných kationtů, 2) regulaci vnitrobuněčného pH, buněčného objemu a membránového potencialu, a 3) odpověď buněk na osmotický šok.
1. Marešová L., Sychrová H. Physiological characterization of Saccharomyces cerevisiae kha1deletion mutants. Molec. Microbiol. 55, 588-600 (2005).
2. Velková K., Sychrová H. The Debaryomyces hansenii NHA1 gene encodes a plasma membrane alkali-metal-cation antiporter with broad substrate specificity. Gene 369, 27-34 (2006).
3. Kinclová-Zimmermannová O., Zavřel M., Sychrová H. Identification of conserved prolyl residue important for transport activity and the substrate specificity range of yeast plasma membrane Na+/H+ antiporters. J. Biol. Chem. 280, 30638-30647 (2005).
4. Papoušková K., Sychrová H., Yarrowia lipolytica possesses two plasma membrane alkali metal cation/H+ antiporters with different functions in cell physiology. FEBS Lett.580, 1971-1976 (2006).
5. Papoušková K., Sychrová H Schizosaccharomyces pombe possesses two plasma membrane alkali metal cation/H+ antiporters differing in their substrate specificity. FEMS Yeast Res. 7, in press (http://www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1567-1364.2006.00178.x) (2007).
6. Kinclová-Zimmermannová O., Zavřel M., Sychrová H. Importance of the seryl and threonyl residues of the fifth transmembrane domain to the substrate specificity of yeast plasma membrane Na+/H+ antiporters. Mol. Membr. Biol.23, 349-361 (2006).
7. Kinclová-Zimmermannová O., Gášková D., Sychrová H. The Na+,K+/H+-antiporter Nha1 influences the plasma membrane potential of Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 6, 792-800 (2006).
8. Kinclová-Zimmermannová O., Sychrová H., Functional study of the Nha1p C-terminus: involvement in cell response to changes in extrenal osmolarity. Curr. Genetics 49, 229-236 (2006).
5.7 Mechanismy sekrece a excitability hypofyzárních buněk
RNDr. Hana Zemková, CSc.
Sekrece hormonů z hypofyzárních buněk je závislá na elektrické aktivitě a uvolňování vápníku z intracelulárních zdrojů. Nalezli jsme dva mechanismy obnovy intracelulárních Ca2+ zdrojů u neonatálních gonádotropních buněk. Jedním je rychlé zpětné vychytávání Ca2+ z cytoplazmy, druhým je pomalejší, ale výkonnější, vstup extracelulárního Ca2+ cestou Na+/Ca2+ výměnného systému v plazmatické membráně [1]. Hypofyzární somatotropní a laktotropní buňky in vitro samovolně vytvářejí salvy akčních potenciálů, které jsou zodpovědné za vysokou klidovou sekreci hormonů. In vivo je tato bazální sekrece pod neustálým inhibičním vlivem hypothalamických faktorů [2]. Kromě hormonů hypofyzární buňky sekretují také ATP, které vyvolává depolarizaci, zvyšuje frekvenci akčních potenciálů a přechodně stimuluje uvolňování luteinizačního hormonu z gonádotropních buněk. Tyto účinky ATP jsou zprostředkovány purinergními P2X2 receptory [3]. V mechanismu sekrece hormonů z hypofyzárních buněk hrají roli také intracelulární cyklické nukleotidy. Nalezli jsme, že zvýšení klidové hladiny cAMP a cGMP vede ke zvýšení elektrické aktivity a sekrece hypofyzárních hormonů, avšak tento účinek cAMP není závislý na protein kinase-A [4].
1. Zemkova H, Balik A, Kretschmannova K, Mazna P, Stojilkovic SS: Recovery of Ins(1,4,5)-Trisphosphate-Dependent Calcium Signaling in Neonatal Gonadotrophs. Cell Calcium 36: 89-97, 2004.
2. Stojilkovic SS, Zemkova H, Van Goor F: Biophysical Basis of Pituitary Cell Type-Specific Ca2+ Signaling-Secretion Coupling. Trends in Endocrinology and Metabolism 16:152-159, 2005.
3. Zemkova H, Balik A, Jiang Y, Kretschmannova K, Stojilkovic SS: Roles of purinergic P2X receptors as pacemaking channels and modulators of calcium-mobilizing pathway in pituitary gonadotrophs. Mol Endocrinol 20:1423-1436, 2006.
4. Gonzalez-Iglesias AE, Jiang Y, Tomic M, Kretschmannova K, Andric SA, Zemkova H, Stojilkovic SS: Dependence of electrical activity and calcium influx-controlled prolactin release on adenylyl cyclase signaling pathway in pituitary lactotrophs. Mol Endocrinol 20:2231-2246, 2006.
5.8 Kompartmentalizace plasmatické membrány kvasinek
Opekarová M.
Ve spolupráci s Ústavem buněčné biologie a rostlinné fyziologie Univerzity v Regensburgu byly dosaženy významné výsledky, které mají závažný dopad na chápání uspořádaní plasmatické membrány eukaryontních buněk. Bylo dokumentováno, že proteiny, které jsou zabudovány v plasmatické membráně, v ní nejsou rozloženy náhodně či rovnoměrně, nýbrž převážná většina z nich je seskupena do shluků, které lze pozorovat pomocí konfokální mikroskopie. Touto metodou byly rozlišeny v plasmatické membráně kvasinek v podstatě tři kompartmenty: Jeden je převážně osídlen shluky několika typů přenášečů živin (protonové symportery, např. Can1p), další kompartment tvoří komplementární síť k těmto shlukům a je osídlen nejhojnějším proteinem kvasničné plasmatické membrány, H+/ATPasou Pma1p. Třetí kompartment obsazují proteiny, které jsou v membráně rozmístěny rovnoměrně (např glukosový přenášeč HXT1). Zatímco rozmístění některých membránových proteinů lze ovlivňovat např. lipidním složením membrány či její deenergizací, rozmístění jiných je neobyčejně stabilní.
Trojrozměrná rekonstrukce distribuce fusních proteinů Can1-GFP (zeleně) a H+/ATPasy-RFP (červeně) v plasmatické membráně Saccharomyces cerevisiae vizualizovaná konfokální mikroskopií.
Grossmann G., Opekarova M., Novakova L., Stolz J., Tanner W.: Lipid raft-based membrane compartmentation of a plant transport protein expressed in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell 5, 945-953 (2006)
Grossmann G., Opekarova M., Malinsky J., Weig-Meckl I., Tanner W.: Membrane potential governs lateral segregation of plasma membrane proteins and lipids in yeast. EMBO J. 26: 1-8 (2007).
5.9 Hřebenové dendrimery obsahující Tn antigen modulují přirozené zabíjení a vyvolávají produkci specifických protilátek proti Tn
Bezouška K.
Metodami peptidové chemie a proteinového síťování byl zkonstruován nový typ sacharidového dendrimeru, v němž jsou zbytky N-acetyl-D-galaktosaminu glykosidicky vázány na peptidové kostře. Celkem byly připraveny tři různé sloučeniny lišící se vzájemně stupněm sacharidové substituce: zatímco látka A(9) obsahovala jediný sacharidový zbytek vázaný na každé větvi, látka B(10) obsahovala takové zbytky dva a látka C(11) dokonce tři. Uvedené sloučeniny interagují s některými rostlinnými lektiny, avšak velmi zajímavé aktivity a neobvyklá selektivita byly zjištěny zejména při reaktivitě s dvěma isoformami receptoru přirozených zabíječských buněk potkana, molekulami NKR-P1A a NKR-P1B. Látka C(11) vykazuje velmi pevnou vazbu na inhibiční receptor NKR-P1B, a v potkaním experimentálním modelu vykazuje specifickou inhibici zabíjení NK buňkami, a to dokonce i v kombinaci s aktivujícími sloučeninami A(9) a B(10). Tento dominantní efekt sloučeniny C(11) byl potvrzen dokonce i u lidských NK buněk a látka je tak jedním z nejúčinnějších dosud známých inhibitorů zabíjení těmito buňkami. Tato aktivita by mohla být významná v případě některých alergických stavů a zejména astmatu, kdy dochází k nadměrné aktivaci iV 14 NKT buněk.
Struktura látky C(11)
Vepřek P, Hajdúch M, Dubák P, Kuklík R, Poláková J, Bezouška K: Comblike dendrimers containing Tn antigen modulate natural killing and induce the production of Tn specific antibodies. J. Med. Chem. 49, 6400-6407 (2006).
5.10 Exocyst u rostlin
Viktor Žárský a kol.
Regulace vzniku tvaru u rostlin je do značné míry spojena s otázkami buněčné polarity, orientovaného buněčného dělení a buněčného růstu. Buněčná polarita je u eukaryot řízena mimo jiné specifickými signálními bílkovinami zvanými malé GTPázy a bílkovinami, které s nimi interagují. Patří mezi ně bílkovinný komplex exocyst složený z 8 podjednotek, který byl dosud znám jen u hub a živočichů, a který jsme my popsali u rostlin. Východiskem byla podrobná bioinformatická analýza genomu Arabidopsis (huseníčku), která ukázala, že bílkoviny do různé míry homologní podjednotkám exocystu jsou kódovany geny Arabidopsis (Cvrčková et al. 2001, Eliáš et al. 2003). Protilátka proti podjednotce exocystu Sec6 ukázala její silnou expresi v pylových láčkách (které vykazují silně polarizovaný růst) a ukázalo se také, že jedna podjednotka Exo70 fúzovaná se zeleným fluorescenčním proteinem (GFP) při expresi v protoplastech nezůstává jen volná, ale vedle lokalizace v jádře je možno pozorovat její shluky na plasmalemě (Eliáš et al. 2003). Překvapením byl objev velké rodiny podjednotek Exo70 u krytosemenných rostlin (např. u rýže přes 30 paralogů) jejichž evoluce doprovází vznik a expansi suchozemských rostlin (Eliáš et al. 2003, Synek et al. 2006). Pro účast exocystu v řízení polarizovaného růstu rostlinných buněk se nám podařilo přinést už také genetické důkazy - pylová zrna nesoucí mutaci v genu pro podjednotku Sec8 neklíčí (Cole et al. 2005) a mutantní rostliny Arabidopsis s nefunkční podjednotkou Exo70a1 projevují mnoho různých poruch jak na úrovni buněk (např. poruchy vývoje kořenových vlásků), tak na úrovni celé rostliny (zakrslost, poruchy v regulaci meristémů, poruchy ve vývoji kořene, anti-senescenční fenotyp). Exocyst je tedy důležitým regulátorem rostlinné morfogeneze.
Cvrčková F., Eliáš M., Hála M., Obermeyer G. a Žárský V.: Small GTPases and conserved signalling pathways in plant cell morphogenesis: from exocytosis to the exocyst. In: Geitmann A., Cresti M., Heath I.B. (eds)., NATO Science Series: Cell biology of plant and fungal tip growth. IOS Press, Amsterdam p.105-122, 2001.
Eliáš M., Drdová E., Žiak D., Bavlnka B., Hála M., Cvrčková F., Soukupová H., Žárský V.: The exocyst complex in plants. Cell Biol. Internat. 27: 199-201, 2003.
Cole R., Synek L., Žárský V., Fowler J.: SEC8, a subunit of the putative Arabidopsis exocyst complex, facilitates pollen germination and competitive pollen tube growth. Plant Physiol. 138:2005-2018, 2005.
Synek L., Schlager N., Eliáš M., Quentin M., Hauser M-T., Žárský V.: AtEXO70A1, a member of a family of putative exocyst subunits specifically expanded in land plants, is important for polar growth and plant development. Plant J. 48:54-72, 2006.
5.11 Kyselina trichloroctová v lesním ekosystému
M. Matucha, S.T. Forczek a J. Rohlenová
Kyselina trichloroctová (TCA), používaná desetiletí jako herbicid, byla pro své fytotoxické vlastnosti v oblasti studia poškození lesa považována za jeden z významných stresorů. Její obsah v jehličí byl přisuzován atmosférické fotooxidaci chlorovaných C2-uhlovodíků produkovaných a používaných ve velkých kvantech jako průmyslová rozpouštědla. Pomocí radioizotopových technik a [1,2-14C]TCA jsme zkoumali nejdříve příjem, translokaci i osud TCA v systému smrk ztepilý/půda /1,2/. Při jednorázové aplikaci byl zjištěn relativně rychlý příjem TCA kořeny a translokace transpiračním proudem spojená s akumulací především v mladém jehličí. Bilancování radioaktivity v daném systému vedlo ke studiu mikrobiální degradace v lesní půdě. Biodegradace až na oxid uhličitý probíhala nejintenzivněji ve fermentačním horizontu při optimální vlhkosti (30-40%) /1,3/*. Její rychlost je v souladu s nálezy nízkých hladin TCA v lesní půdě. Zároveň byla zjištěna i biodegradace v jehličí, zejména ve fylosféře /2/. Při letních teplotách dochází i k eliminaci TCA její pomalou dekarboxylací v jehličí /4/. V izolovaných chloroplastech z jehličí byla pomocí námi vypracované metody (4) zjištěna biooxidace perchlorethylenu na TCA (7). Byl studován rovněž vznik TCA v půdě mikrobiální chlorací půdní organické hmoty. Užitím chloru 36Cl byl prokázán vznik TCA a DCA (kyselina dichloroctová) nejprve chlorací suspenzí huminových látek a pak přímo v půdě za přirozených podmínek /5,6/. Tento výzkum značně přispěl k poznání, že TCA není jen polutant antropogenního původu, ale je jako intermediát i součástí přírodního cyklu chloru v lesním ekosystému; ten se dále studuje#.
v levo: Chlorotické změny v jehličí způsobené TCA
v pravo: Hyfy hub ve fylosféře jehlice smrku
1. Matucha, M., Forczek, S.T., Gryndler, M., Uhlířová, H., Fuksová, K., Schröder, P. (2003) "Trichloroacetic Acid in Norway Spruce/Soil-System. I. Biodegradation in Soil", Chemosphere 50, 303-309
2. Forczek, S.T., Uhlířová, H., Gryndler, M., Albrechtová, J., Fuksová, K., Vágner, M., Schröder, P., Matucha, M. (2004) "Trichloroacetic Acid In Norway Spruce/Soil-System. II. Degradation in the Plant", Chemosphere 56, 327-333
3. Schröder, P., Matucha, M., Forczek, S.T., Uhlířová, H., Fuksová, K., Albrechtová, J. (2003) "Uptake, Translocation and Fate of Trichloroacetic Acid in Norway Spruce/Soil System", Chemosphere, 52, 437-442
4. Matucha, M., Rohlenová, J., Forczek, S.T., Uhlířová, H., Gryndler, M., Fuksová, K., Schröder, P. (2005) "Determination of TCA in Environmental Studies Using Carbon 14 and Chlorine 36", Chemosphere 63, 1924-1932
5. Matucha, M., Gryndler, M., Schröder, P. Forczek, S.T., Uhlířová, H., Fuksová, K., Rohlenová, J. (2007) "Chloroacetic acids - degradation intermediates of organic matter in forest soil" Soil Biol. Biochem., 39, 382-385
6. Matucha, M., Gryndler, Forczek, S.T., M., Schröder, P., Bastviken, D., Rohlenová, J, Uhlířová, H., Fuksová, K. (2007) "A Chlorine-36 and Carbon-14 Study of the Role of Chlorine in the Forest Ecosystem", J. Labelled Cpd. Radioph., 50, 1-3
7. Weissflog, L., Krueger, G., Forczek, S.T., Lange, Ch. A., Kotte, K., Pfennigsdorff, A., Rohlenová, J., Fuksová, K., Uhlířová, H., Matucha, M., Schröder, P. (2007) "Oxidative Biodegradation of Tetrachloroethene in Needles of Norway Spruce (Picea abies L.)" South Afric. J. Botany, 73, 89-96
Spolupráce s prof. P. Schröderem* (GSF Neuherberg, Německo) a doc. D. Bastvikenem# (University Linköping, Švédsko).
5.12 Úloha individuální vnímavosti a oprav DNA v mechanismech genových poškození a dopad na vznik nádorů
Proces DNA opravy je klíčový při udržení celistvosti genomu a prevenci mutagenních a karcinogenních účinků. Oprava DNA probíha dle různých typů poškození různymi mechanizmy (od vyštípnutí několika málo bazí přes odstranění větších úseků DNA, přeskupení bazí v jenom nebo obou řetězcích až po opravu chybného párování). Geny DNA opravy bývají polymorfní (dědičně podmíněný výskyt variant, které se liší jenom nepatrně). Polymorfismy v kódujících a regulačních oblastech mohou vést ke strukturálním změnám v enzymech provádějících opravu DNA. Nicméně vztah mezi genotypy DNA opravy a jejich funkčními důsledky není znám. V našich studiích jsme sledovali vztahy mezi polymorfismy v genech opravy DNA a schopností odstranit poškozené báze a obnovit celistvost DNA. Tato schopnost a schopnost opravy oxidativního DNA poškození byla významně snížená u zdravých jedinců v souvislosti se změnami kódu v kodónu 399 genu XRCC1 a kodónu 326 genu hOGG1 (záměna jedné aminokyseliny za jinou). Při kombinaci změn ve třech různých kodonech genu XRCC1 a kodónu 148 genu APE1 se ukázala významně snižená schopnost zmíněné opravy DNA, zatímco kombinace změn v kódech genů hOGG1 a APE1 vede ke snížení schopnosti opravy oxidativního DNA poškození. U myší vystavených účinkům 1,3- butadienu (BD) v střednědobém pokusu (28 dní ovlivnění BD a 28 dní sledování po ukončení vdechování BD) aktivita tohoto typu opravy postupně vzrůstala s maximem ve 29. dni (1. den po ukončení vdechování BD) a návratem k výchozím hodnotám v 56. dni (28. den po ukončení vdechování BD). Ve studiích u osob, které jsou vystaveny účinkům karcinogenních látek ve svém zaměstnání, jsme nalezli významné snížení DNA poškození, zatímco schopnost opravy DNA byla významně zvýšena. Domníváme se, že dochází k adaptivní indukci opravy DNA, což může být důvod skutečnosti, že se nádorová onemocnění u osob v rizikových provozech nevyskytují zdaleka tak často, jak by z povahy karcinogenních látek vyplývalo.
Vodička P, Štětina R, Šmerák P, Vodičková L, Naccarati A, Bárta I, Hemminki K. Micronuclei, single-strand breaks in DNA and DNA repair activity in mice exposed to 1,3-butadiene by inhalation. Mutat Res 2006, 608:49-57. IF=2.188
Vodička P, Štětina R, Poláková V, Tulupová E, Naccarati A, Vodičková L, Kumar R, Hánová M, Pardini B, Slyšková J, Mušák L, De Palma G, Souček P, Hemminki K. Association of DNA repair polymorphisms with DNA repair functional outcomes in healthy human subjects. Carcinogenesis 2006 Oct 6; [Epub ahead of print]. IF=5.108
Vodička P, Koskinen M, Naccarati A, Oesch-Bartlomowicz B, Vodičková L, Hemminki K, Oesch F. Styrene metabolism, genotoxicity, and potential carcinogenicity. Drug Metabolism Reviews, 2006;38: 1-49. IF=5.153
5.13 Biodegradovatelné polymerní makroporézní hydrogely pro terapii míšních lézí
Traumatická míšní léze je doprovázena destrukcí míšní tkáně a vznikem gliové jizvy; změny, ke kterým dochází v místě poranění brání regeneraci a funkční obnově poraněné míchy. Jedním z experimentálních terapeutických postupů, které mohou napomoci obnově funkce poškozené míchy je i chirurgické vytnutí poškozené tkáně a její nahrazení vhodným biomateriálem, který poskytne nezbytnou strukturu pro regeneraci míšní tkáně. Implantovaný biomateriál může současně sloužit jako nosič buněk (například kmenových), které mohou napomoci regenerativním procesům v místě poranění.
Ústav experimentální medicíny AV ČR spolupracuje s Ústavem makromolekulární chemie AV ČR na přípravě makroporézních hydrogelů určených pro terapii míšního poranění. Vyvíjené biomateriály, které jsou založené na kopolymerech 2-hydroxypropylmetakrylamidu (HPMA) nebo hydroxyetylmetakrylátu (HEMA) mají mechanické vlastnosti stejné jako tkáň míchy, jsou biokompatibilní a po implantaci do míšní tkáně do nich vrůstají elementy míšní tkáně, například vazivo, kapiláry a výběžky nervových buněk. Tyto hydrogely je možné využít také ke kultivaci buněk (například stromálních buněk kostní dřeně nebo buněk olfaktorické glie) in vitro a jejich následnému přenosu do míšní léze. Při implantaci do modelu míšního poranění (balónková léze) zmenšovaly tyto hydrogely velikost pseudocyst v místě léze.
Na základě dosažených výsledků jsme modifikovali připravené hydrogely tak, aby byly v míše hydrolyticky biodegradovatelné. Připravili jsme sérii makroporézních hydrogelů s dobou degradace 3 až 35 dnů a v experimentálním modelu akutního poranění míchy jsme sledovali závislost vrůstání jednotlivých prvků míšní tkáně, zejména výběžků nervových buněk, do hydrogelů na době jejich biodegradace. Ukázalo se, že z hlediska optimální tkáňové regenerace je nezbytné, aby minimálně 7 dní po implantaci zůstával hydrogel beze změn a poté docházelo během 30 dnů k jeho rovnoměrné hydrolýze a odstraňování jejích produktů. V takto připraveném biomateriálu se zpožděným nástupem hydrolýzy dochází k rovnoměrnému vrůstání míšní tkáně, která vytváří vhodné prostředí pro postupnou regeneraci výběžků nervových buněk. Naše výsledky ukazují, že přemostění míšního poranění pomocí biodegradovatelných makroporézních hydrogelů je slibnou strategií pro terapii míšního poranění.
Odkazy:
Lesný P, Přádný M, Jendelová P, Michálek J, Vacík J, Syková E. (2006) Macroporous hydrogels based on 2-hydroxyethyl methacrylate. Part 4: Growth of rat bone marrow stromal cells in three-dimensional hydrogels with positive and negative surface charges and in polyelectrolyte complexes. J Mater Sci Mater Med. 17:829-33. IF=1.248
Přádný M, Michálek J, Lesný P, Hejčl A, Vacík J, Šlouf M, Syková E. (2006). Macroporous hydrogels based on 2-hydroxyethyl methacrylate. Part 5: Hydrolytically degradable materials. J Mater Sci 17:1357-64. IF=1.128
Syková E, Jendelová P, Urdzíková L, Lesný P, Hejčl A. (2006) Bone marrow stem cells and polymer hydrogels - two strategies for spinal cord injury repair. Cell Mol Neurobiol. IF=2.022
5.14 HIC1 snižuje aktivitu signalizace Wnt prostřednictvím strhávání faktoru TCF-4 a β-kateninu do jaderných tělísek
Valenta, T., Lukas, J., Doubravska, L., Fafilek, B., Korinek, V.: HIC1 attenuates Wnt signaling by recruitment of TCF-4 and beta-catenin to the nuclear bodies. EMBO J. 25(11):2326-37 (2006)
Osud každé buňky ovlivňuje relativně malé množství signalizačních drah, které řídí většinu důležitých vnitrobuněčných fyziologických dějů. Jednou takovou drahou je signální kaskáda zvaná Wnt. Ta je iniciovaná velkou skupinou strukturně podobných sekretovaných proteinů (nesou jméno jako celá dráha; např. Wnt1, Wnt3, apod.), které regulují dělení, diferenciaci a přežívání cílových buněk. Nefyziologické spuštění této signalizační dráhy je spojeno s neregulovaným buněčným dělením a vede tak ke vzniku nádorů a k rakovině. Rozhodující událostí pro přenos signálu je v případě signalizace Wnt stabilizace proteinu β-katenin v cytoplazmě cílové buňky. V situaci, kdy buňky nejsou stimulovány molekulou Wnt, je většina β-kateninu vázána do mezibuněčných spojů a množství volného β-kateninu v cytoplazmě je na velmi nízké úrovni. Vazba ligandu Wnt na membránový receptor na cílové buňce vyvolává řadu molekulárních procesů, jejichž výsledkem je nárůst koncentrace β-kateninu v cytoplazmě a přemístění tohoto proteinu do buněčného jádra. V jádře β-katenin interaguje s transkripčními faktory rodiny TCF/LEF (z anglického T-Cell Factor/Lymphoid Enhancer Factor) a spolu s nimi aktivuje přepis relativně malého množství určitých cílových genů. Konečným výsledkem signalizace Wnt je tedy produkce nových proteinů způsobujících změnu fyziologických vlastností cílové buňky. V buněčném jádře existují proteiny, které mohou významně ovlivnit úroveň transkripce zahajované komplexy TCF/ β-katenin. V předkládané práci jsme ukázali, že jedním takovým proteinem je HIC1 (z anglického Hypermethylated In Cancer 1). Zajímavé je, že umlčení genu HIC1 - jedná se většinou o epigenetickou inaktivaci způsobenou methylací regulačních sekvencí genu - je nezbytnou událostí při vzniku většiny lidských nádorů. Protein HIC1 tedy působí jako tzv. nádorový supresor. Pokud je v buňce gen HIC1 exprimován, pak je výsledný protein lokalizován v buněčném jádře, a to v několika stovkách malých tělísek (tzv. tělíska HIC). Pomocí řady biochemických a molekulárně biologických metod jsme ukázali, že protein HIC1 se přímo váže s faktorem TCF-4 (jedním z členů rodiny TCF/LEF). Důsledkem této vazby je přesun proteinu TCF-4 do jaderných tělísek HIC. Takový přesun vede k "odpojení" TCF-4 (a také β-kateninu) od vazebných míst v regulačních oblastech cílových genů signalizace Wnt. Konečným důsledkem uvedeného přesunu je výrazné snížení exprese genů regulovaných komplexy TCF-4/ β-katenin. Funkčně je tedy HIC1 transkripčním inhibitorem dráhy Wnt. V práci jsme dále ukázali, že celkové množství proteinu TCF-4 přemístěné do tělísek HIC, (a tedy i celková úroveň represe cílových genů dráhy Wnt) je závislé na polypeptidu CtBP (z anglického C-terminal Binding Protein). Tento protein interaguje s oběma zmíněnými faktory (tj. TCF-4 a HIC1) a patrně se uplatňuje jako strukturní molekula při formování tělísek HIC. Důležitým závěrem článku je hypotéza, že zvýšená transkripce cílových genů signalizace Wnt, ke které dochází v buňkách s umlčenou expresí genu HIC1, může být důležitým mechanismem při vzniku nebo v procesu vývoje lidských nádorů a rakoviny.
Obr. Současná interakce mezi proteiny CtBP, TCF-4 a HIC1 je nutná pro účinné přemístění transkripčního faktoru TCF-4 do jaderných tělísek. Buňky CtBP(-/-) (neobsahují CtBP) nebo CtBP1(+) (produkují CtBP1) byly transfekovány uvedenými vektory (vlevo) a obarveny pomocí protilátek anti-Flag (barví HIC1) a anti-TCF-4. Z panelů umístěných napravo ukazujích intenzitu fluorescence stanovenou v oblasti výseče je patrné, že relokace TCF-4 je méně efektivní u buněk, které neexprimují CtBP.
Snímky z konfokálního mikroskopu Leica TCS SP
5.15 Význam aktivity Aurory B a fosforylace histonu H3 v procesu kondenzace chromosomů během meiotického zrání prasečích oocytů
Během meiotického zrání prasečích oocytů byla studována role enzymu Aurory B protein kinázy a jejího substrátu histonu H3 v procesu kondenzace chromosomů. Byly sledovány jejich fosforylace, které jsou známkou jejich aktivity. Ukázalo se, že fosforylace histonu H3 na aminokyselinovém zbytku serinu 10 (Ser-10) a stejně tak fosforylace Aurory B na threoninu (Thr-232), korelují s postupnou kondenzací chromosomů, ale fosforylace histonu H3 na Ser 28 ne.
Po ošetření oocytů inhibitory, buď inhibitorem cyklin dependentních protein kináz, Butyrolactonu I, či inhibitorem syntézy proteinů, cykloheximidu, dochází k zastavení vývoje oocytů ve fázi tzv. zárodečného váčku, ve které zůstává neporušena jaderná membrána, ale v jádře dochází k částečné kondenzaci chromatinu. Nicméně aktivita Aurora B kinázy stejně tak i fosforylace histonu H3 na Ser-10 není v těchto oocytech detekována. Tyto výsledky ukazují, že aktivita Aurory B protein kinázy a fosforylace histonu H3 nejsou nutné pro kondenzaci chromosomů v prasečích oocytech, a uplatňují se pravděpodobně při další reorganizaci chromosomů během meiozy.
Obr.: Pomocí imunofluorescenčního barvení byl lokalizován histon H3 fosforylovaný na Ser 10 a Ser 28 během zrání prasečích oocytů a v oocytech zastavených po působení cykloheximidu v GV-IV fázi. Chromatin byl barven Hoechstem (sloupce DNA), fosforylovaný histon H3 na Ser 10 (2. sloupec) a Ser 28 (4. sloupec) byl barven pomocí anti-králičí sekundární protilátky Alexa Fluor 594
GV - oocyt na počátku zrání (hned po izolaci). MI - oocyt v metafázi I. MII - oocyt v metafázi II, CHX - cykloheximidem ošetřené oocyty zablokované v GVIV fázi, v jádře jsou viditelné zkondensované chromosomy
Měřítko 50 µm. Tento experiment byl proveden dvakrát vždy s 10-15 oocyty.
Jelínková, L., Kubelka, M. (2006): Neither Aurora kinase B activity nor histone H3 phosphorylation is essential for chromosome condensation during meiotic maturation of porcine oocytes. Biol.Reprod., 74:905-912.
5.16 Apoptóza v odontogenezi
Buněčná smrt (apoptóza) a proliferace jsou důležité procesy, které se podílejí na vytváření orgánových základů během embryonálního vývoje. Pochopení apoptotických mechanismů uplatňujících se při odontogenezi je v centru zájmu také z důvodu možných cílených modulací a klinických aplikací (molekulární stomatologie). 3D rekonstrukce rozložení proliferujících a apoptotických buněk moláru hraboše v období rané morfogeneze umožnila srovnat získaná data se situací u myši. Kaspáza-3 je centrální molekulou apoptotické mašinérie. Rozložení prokaspázy-3 a aktivní kaspázy-3 bylo detekováno během vývoje molárů. Kaspáza-3, kaspáza-9 a Apaf-1 deficientní fenotypy byly hodnoceny s využitím knock-out myší. Z receptorových molekulárních drah bylo studováno zapojení komponent CD 95 receptorové signální dráhy v dentální apoptóze. Získané výsledky výrazně přispěly k poznání molekulárních mechanismy dentální apoptózy, které dosud nebyly známy.
- Šetková J, Lesot H, Matalová E, Witter K, Matulová P, Míšek I 2006: Proliferation and apoptosis in early molar morphogenesis - voles as models in odontogenesis. Int J Dev Biol 50: 481-489
- Matalová E, Kovářů F, Míšek M 2006: Caspase 3 activation in the primary enamel knot of developing molar tooth. Physiol Res 55: 183-188
- Matalová E, Sharpe PT, Lakhani SA, Roth KA, Flavell RA, Šetková J, Míšek I, Tucker AS 2006: Molar tooth development in caspase-3 deficient mice. Int J Dev Biol 50: 491-497
- Matalová E, Šetková J, Blackburn J, Míšek I, Sharpe PT 2006: CD 95 mediated apoptosis in embryogenesis: implication in tooth development. Orthodontics and Craniofacial Res, 9: 111-116 (nemá zatím IF, nový časopis)
- Šetková J, Matalová E, Sharpe PT, Míšek I, Tucker AS 2006: Primary enamel knot cell death in Apaf-1 and caspase-9 deficient mice. Arch Oral Biol 52: 15-19).
Obr.: Morfologie zubního základu moláru, detekce apoptózy v primárním sklovinném uzlu s využitím techniky TUNEL (červené šipky) a průkaz negativní proliferace v této oblasti (modré šipky) s využitím protilátek proti PCNA.
5.17 DNA jako klíč k rekonstrukci klimatických změn
Jednou z nejdiskutovanějších otázek týkajících se vlivu klimatických změn na živou přírodu v Evropě je jak daleko na severu existovala glaciální refugia pro druhy mírného pásma během poslední doby ledové. Za použití molekulárně fylogeografického přístupu jsme analyzovali populace modelového druhu norníka rudého (Clethrionomys glareolus) ve střední Evropě. Norník je lesní hlodavec, který obývá většinu Evropy, a naše genetická studie ukázala, že izolovaná populace tohoto druhu přežila nejchladnější období poslední doby ledové (před 25000-10000 lety) v blízkosti karpatských pohoří, tedy mnohem severněji, než byla dosud známá středomořská refugia většiny ostatních evropských druhů živočichů a rostlin. Odhady toku genů založené na výpočtech populačně-genetického modelu ukázaly, že karpatská refugiální populace norníka sloužila jako významný zdroj postglaciální kolonizace zaledněních území Evropy. Naše výsledky podporují výsledky paleontologů a představují dosud nejjasnější fylogeografický důkaz pro existenci severního glaciálního refugia pro lesní druhy v Evropě.
Obr. Norník rudý představuje mimořádně vhodný modelový organismus pro studium klimatických změn.
Kotlík, P., Deffontaine, V., Mascheretti, S., Zima, J., Michaux, J. R., Searle, J. B. (2006): A nothern glacial refugium for bank voles (Clethrionomys glareolus). PNAS, vol. 103: 14860- 14864
