Seznam anotací:

1. Strukturní dynamika RNA na atomární úrovni (Biofyzikální ústav)
2. Objasnění role proteinu HMGB1 ve funkci lidské topoizomerázy IIα a při udržování genomové stability (Biofyzikální ústav)
3. Účinný cytotoxický fotoaktivovatelný komplex platiny (Biofyzikální ústav)
4. Přímý vztah mezi variantami mitochondriálního genomu a rizikovými faktory pro diabetes 2 typu u konplastických kmenů (Fyziologický ústav)
5. Cirkadiánní hodiny v epiteliálních buňkách tlustého střeva laboratorního potkana (Fyziologický ústav)
6. Modulace lokomoce a prostorového chování pomocí ligandů dopaminových D1 a D2 receptorů (Fyziologický ústav)
7. Mechanismus regulace DNA-vazebných vlastností transkripčního faktoru FOXO4 (Fyziologický ústav)
8. Molekulární mechanizmy aktivace a desenzitizace kapsaicinového receptoru (TRPV1). Příspěvek k porozumění mechanizmům vzniku a léčení bolesti (Fyziologický ústav)
9. Spektrum cytokinů v mléku a kolostru (Mikrobiologický ústav)
10. Velké propeptidy plísňových β-N-acetylhexosaminidas jsou novými regulátory enzymů, které musí být intracelulárně odštěpené aby mohly participovat na aktivaci, dimerizaci a sekreci mateřských enzymů (Mikrobiologický ústav)
11. Nový typ oxidasy u hub (Mikrobiologický ústav)
12. Pochopení role přenašečů auxinu z buněk (Ústav experimentální botaniky)
13. Cytokininové receptory (Ústav experimentální botaniky)
14. Charakterizace lidských embryonálních kmenových buněk mezinárodní iniciativou pro kmenové buňky (Ústav experimentální medicíny)
15. Onemocnění dolních cest dýchacích v časném dětství a znečištění ovzduší. (Ústav experimentální medicíny)
16. Membránový potenciál řídí laterální segregaci proteinů a lipidů v plasmatické membráně kvasinek (Ústav experimentální medicíny)
17. Neplodnost jako důsledek neúplné meiotické inaktivace genů na chromosomu X (Ústav molekulární genetiky)
18. Resistence drůbežích linií vůči sarkomovým a leukózovým virům podmíněná mutacemi specifických receptorů (Ústav molekulární genetiky)
19. Proteiny Myb indukují v buňkách neurální lišty melanocytární osud cestou aktivace receptoru c-kit (Ústav molekulární genetiky)
20. Proteomický přístup ke studiu diferenciace nervových kmenových buněk (Ústav živočišné fyziologie a genetiky)
21. Formování inkudomaleálního kloubu – úloha apoptózy, migrace a downregulace (Ústav živočišné fyziologie a genetiky)
22. Genetická analýza autosomálních a na X chromozóm vázaných znaků v hybridní zóně domácích myší (Ústav živočišné fyziologie a genetiky)

5.1 Strukturní dynamika RNA na atomární úrovni.
(Biofyzikální ústav)

Je známo, že biochemické a biologické funkce molekul RNA jsou určeny jejich prostorovou strukturou. V tomto projektu autoři prokázali, že aplikace nejmodernějších počítačových simulací (molekulová dynamika na atomární úrovni popisu) v kombinaci s bioinformatickými metodami představuje nový překvapivě účinný nástroj, který dokáže podstatně doplnit stávající experimentální metody. To demonstrovali na helixech 42-44 velké podjednotky ribosomu, což je klíčový segment, kde se mj. váží elongační faktory a příchozí t-RNA. Pomocí simulací odhalili, že tato část ribozomální RNA byla evolucí zkonstruována jako unikátní směrová flexibilní RNA nanopaže. Tento RNA segment je složen ze dvou rigidních helixů prostřídaných dvěma flexibilními klouby a je zakončen adjustovatelnou hlavicí schopnou složitých molekulových interakcí. Bioinformatickou analýzou pak prokázali, že tyto unikátní elastické vlastnosti jsou do detailu konzervovány během evoluce ve všech třech doménách a zřejmě zachování vysoce specifické elasticity tohoto RNA segmentu představuje klíčový požadavek na sekvenci bází v této části ribozomálního stroje. Zcela jiný typ strukturní dynamiky založený na flexibilitě nespárovaných konzervovaných purinových bází detekovali u dimerické „kissing-loop“ RNA z iniciačního místa dimerizace HIV-1 RNA. Oproti tomu žádnou zajímavou strukturní dynamiku vlastní molekuly RNA neprokázali u vlásenkového ribozymu. Přesto však v katalytickém centru ribozymu odhalili unikátní řetězec strukturovaných molekul vody, který se zřejmě aktivně podílí na katalýze. Sumárně, molekulové simulace představují účinný nástroj umožňující odhalovat rozmanitost strategií, jimiž funkční molekuly RNA dokáží optimalizovat nejrůznější detaily svých strukturně dynamických vlastností a ladit tak své biochemické funkce. V řadě případů představují simulace jediný nástroj, který umožňuje tyto vlastnosti studovat.

A. Pozice GTP-ase associated center RNA (červeně) v krystalové struktuře velké podjednotky bakteriálního ribosomu (modře). B. GTP-ase associated center RNA jako komplikovaná dynamická RNA nanopaže, šipky znázorňují pohyby kolem dvou flexibilních kloubů X a Y

Rázga, F., Koča, J., Mokdad, A., Šponer, J.: Elastic properites of ribosomal RNA building blocks: molecular dynamics of the GTPase-associated center rRNA. – Nucleic Acids Research 35, 4007-4017 (2007)
Réblová, K., Fadrná, E., Sarzynska, J., Kulinski, T., Kulhánek, P., Ennifar, E., Koča, J., Šponer, J.:Conformations of flanking bases in HIV-1 RNA DIS kissing complexes studied by Molecular Dynamics. - Biophysical Journal, 93, 3932-3949 (2007)
Rhodes, M.M., Réblová, K. Šponer, J. Walter, N.G.: Trapped water molecules are essential to structural dynamics and function of a ribozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 103, 13380-13385 (2006).

Kontaktní osoba: Jiří Šponer, sponer@ncbr.chemi.muni.cz

5.2 Objasnění role proteinu HMGB1 ve funkci lidské topoizomerázy IIα a při udržování genomové stability
(Biofyzikální ústav)

Topoizomeráza IIα (topo IIα) je významný buněčný enzym a jeho jedinečná dekatenační aktivita hraje důležitou roli v celé řadě dějů souvisejících s dynamikou chromozomů jako např. replikace a segregace chromozomů během mitózy. Podařilo se nám jako první laboratoři prokázat, že chromozomální protein HMGB1 (člen velké rodiny proteinů obsahujících HMG-box doménu s významnou funkcí během replikace DNA, transkripce, rekombinace a reparace DNA) se váže s lidskou topo IIα a podporuje katenaci a dekatenaci cirkulární DNA vlivem topo IIα. Stimulaci enzymatické aktivity topo IIα vlivem HMGB1 jsme objasnili jako důsledek zesílení vazby topo IIα na DNA a jejího zvýšeného štěpení. Vzhledem ke skutečnosti, že ve většině lidských nádorů dochází k vyšší expresi proteinu HMGB1, další výzkum nám může pomoci zjistit zda existuje korelace mezi zvýšenou expresí HMGB1 a aktivitou topo IIα v nádorech. Genomová nestabilita vzniká rozličnými mechanismy. Jeden z nich je ztráta funkce telomer, specifických nukleoproteinových struktur tvořící konce chromozómů, které je chrání před rekombinací a degradací. Aby se zabránilo zkracování konců chromozomů během replikace, aktivuje buňka enzym telomerázu. V buňkách dochází ke značné aktivaci telomerázy pouze během několika prvních týdnů embryogeneze a posléze dochází k útlumu její exprese. Vysoká hladina telomerázy je rovněž charakteristickým znakem nádorových buněk. Jako první laboratoři se nám podařilo prokázat významný pokles aktivity telomerázy v myších fibroblastech (MEF) s nefunkčním HMGB1 genem. Prokázali jsme, že HMGB1 aktivuje telomerázu mechanismem, který vylučuje vliv tohoto proteinu na transkripci základních podjednotek telomerázy (TER a TERT). Možným vysvětlením vlivu HMGB1 na aktivitu telomerázy je funkce tohoto proteinu jako „chaperonu“ podporujícího uspořádání obou enzymových podjednotek telomerázy ve funkční enzym. Získané výsledky pomohou objasnit funkci HMGB1 v udržování genomové stability.

Katalytický cyklus topoisomerázy IIα a HMGB1. Vazba dvou dvouřetězcových duplexů DNA G (červeně) a T (modře) iniciuje katalytický cyklus (krok 1). Šipky označují jednotlivé kroky katalytického cyklu topo IIα stimulované proteinem HMGB1: vazba DNA (1), štěpení DNA (3/4) a částečná stimulace hydrolýzy ATP (6).

Štros, M., Bačíková, A., Polanská, E., Štokrová, J., and Strauss, F.: HMGB1 interacts with human topoisomerase II#945 and stimulates its catalytic activity.- Nucleic Acids Res. 35, 15: 5001-5013 (2007)
Štros, M., Launholt, D., and Grasser, K.: The HMG-box: a versatile protein domain occurring in a wide variety of DNA-binding proteins. - Cell Mol Life Sci. 64, 19-20:2590-2606 (2007)

Kontaktní osoba: Michal Štros, tel: +420541517183, e-mail: stros@ibp.cz

5.3 Účinný cytotoxický fotoaktivovatelný komplex platiny
(Biofyzikální ústav)

Autoři ukazují, že klinicky neúčinný komplex trans-[PtCl₂(NH₃)₂] se stane po ozáření světlem (viditelným a UVA) cytotoxickým v řadě nádorových buněk včetně buněk rezistentních vůči působení konvenční cisplatiny. Dále autoři ukazují, že nový komplex trans,trans,trans-[Pt(N₃)₂(OH)₂(NH₃)(pyridin)] (1), obsahující atom platiny v oxidačním stupni IV, je velmi stabilní ve tmě i v přítomnosti buněčných redukčních činidel, jako je glutathion. Naproti tomu komplex 1 ochotně podléhá světlem vyvolaným reakcím vedoucím k výměně ligandů a redukci komplexu. Jestliže je komplex 1 fotoaktivován v buňkách citlivých i rezistentních k cisplatině, stává se vysoce toxickým. Cisplatina je v buňce cílena na DNA a úrovně modifikace DNA vyvolané v kožních buňkách komplexem 1 byly podobné úrovním vyvolaným cisplatinou. Cisplatina však vytváří na DNA zejména adukty mezi dvěma sousedními zbytky guaninu uvnitř jednoho řetězce, zatímco fotoaktivovaný komplex 1 rychle vytváří zejména stabilní můstky uvnitř jednoho řetězce dvoušroubovicové DNA mezi dvěma zbytky guaninu oddělenými třetí bází. Komplex 1 rovněž vytváří ve výrazném zastoupení meziřetězcové můstky v DNA a můstky mezi DNA a proteiny. Je také důležité, že opravná syntéza DNA modifikované fotoaktivovaným komplexem 1 je výrazně nižší než syntéza DNA modifikované cisplatinou nebo transplatinou ve tmě. Unikátní poškození DNA modifikované fotoaktivovaným komplexem 1 bylo potvrzeno také pokusy využívajícími „single-cell electrophoresis“. Autoři dále ukazují, že smrt nádorových buněk není pouze závislá na aktivaci dráhy kaspázy 3 a také, že, na rozdíl od cisplatiny, nedochází po fotoaktivaci komplexu 1 k akumulaci proteinu p53 buňkách. Nový komplex 1 vykazuje tedy pozoruhodné vlastnosti a je kandidátem pro použití ve fotoaktivované chemoterapii rakoviny.

Heringova, P., Woods, J., Mackay, F.S., Kasparkova, J., Sadler, P.J., Brabec, V.: Transplatin is cytotoxic when photoactivated: Enhanced formation of DNA cross-links. – J Med Chem, 49, 7792-7798 (2006)
Mackay, F.S., Woods, J.A., Heringová, P., Kašpárková, J., Pizarro, A.M., Moggach, S.A., Parsons, S., Brabec, V., Sadler, P.J.: A potent cytotoxic photoactivated platinum complex. – Proc Natl Acad Sci USA, v tisku

Kontaktní osoba: Viktor Brabec, 541517148, brabec@ibp.cz

5.4 Přímý vztah mezi variantami mitochondriálního genomu a rizikovými faktory pro diabetes 2 typu u konplastických kmenů
(Fyziologický ústav)

V rámci Centra aplikované genomiky se podařilo prokázat přímou vazbu mezi variantami mitochondriálního genomu (mtDNA) a rizikovými faktory pro diabetes pomocí konplastických kmenů. V nedávné době byly získány nepřímé důkazy pro vztah mezi variantami mtDNA a rizikovými faktory pro diabetes 2. typu. Získání přímých důkazů je však obtížné, protože: 1) fenotypické účinky asociované s variabilitou mtDNA se dají těžko odhadnout vzhledem k nedefinovaným interakcím s jaderným genomem a faktory prostředí nebo v důsledku imprintingu a 2) nejsou dostupné zvířecí modely, které by umožnily in vivo analýzy účinků variant mtDNA na komplexní metabolické fenotypy. Nahrazení různých mitochondriálních genomů v rámci identického jaderného genetického pozadí u konplastických inbredních kmenů umožňuje získat přímé důkazy pro účinky variant mtDNA na komplexní znaky. Autoři vytvořili SHR.BN-mtDNA konplastické kmeny přenesením mtDNA z kmene Brown Norway (BN/Crl) na genetické pozadí spontánně hypertenzních potkanů kmene SHR/Ola. Kmeny SHR a SHR.BN-mtDNA mají identický jaderný genom, ale liší se v řadě mutací v mtDNA, z nichž 7 podmiňuje záměny aminokyselin v proteinech důležitých pro oxidační fosforylaci, včetně unikátní mutace v COX1 genu, který kóduje katalytickou podjednotku cytochrom c oxidázy – terminálního enzymu respiračního řetězce. Konplastické kmeny se liší v důležitých rizikových faktorech pro diabetes 2. typu, jako jsou hladiny glykogenu a ATP ve svalech, tolerance ke glukóze nebo v sérových koncentracích lipidů. Tyto výsledky představují první přímé důkazy pro vztah mezi variantami mtDNA a rizikovými faktory pro diabetes 2. typu a potvrzují, že spontánní variabilita mitochondriálního genomu může sama o sobě být příčinou metabolických poruch relevantních pro patogenezi komplexních chorob.

Kmeny se stejným nukleárním genomem spontánně hypertenzních potkanů (SHR), ale s odlišnými genomy mitochondriální DNA, BN (Brown Norway) versus SHR

M. Pravenec, M. Hyakukoku, J. Houštěk, V. Zídek, V. Landa, P. Mlejnek, I. Mikšík, K. Dudová-Mothejzíková, P. Pecina, M. Vrbacký, Z. Drahota, A. Vojtíšková, T. Mráček, L. Kazdová, O. Oliyarnyk, J. Wang, C. Ho, N. Qi, K. Sugimoto, T. W. Kurtz: Direct linkage of mitochondrial genome variation to risk factors for type 2 diabetes in conplastic strains. Genome Res 17:1319-1326, 2007 (IF 10,256)

Kontaktní osoba: Ing. Michal Pravenec, DrSc, tel. 241062793, pravenec@biomed.cas.cz

(Fyziologický ústav)
Autoři prokázali, že epiteliální buňky tlustého střeva obsahují denní, neboli cirkadiánní hodiny. Zjistili, že v epitelu tlustého střeva jsou během dne a noci rytmicky s čtyřiadvacetihodinovou periodou spínány geny zodpovědné za chod cirkadiánních hodin, tzv. hodinové geny, a že se rytmicky mění i hladiny proteinových produktů těchto genů, které jsou základními prvky molekulárního hodinového mechanismu. Cirkadiánní hodiny v tlustém střevě běží ve stejné fázi s cirkadiánními hodinami v játrech, ale jsou fázově opožděny za centrálními hodinami v suprachiasmatických jádrech v mozku. Dále autoři prokázali, že tyto nově popsané cirkadiánní hodiny ve střevním epitelu řídí rytmické funkce střeva, neboť například kontrolují expresi dominantního elektroneutrálního Na+/H+ přenašeče NHE3. Výsledky také přinášejí nový poznatek, že změna režimu v příjmu potravy významně seřizuje střevní hodiny, a to i zcela nezávisle na signálech z řídících centrálních hodin uložených v suprachiasmatických jádrech v mozku. Tyto výsledky ukazují na význam existence cirkadiánních hodin v tlustém střevě a jejich synchronizace s vnějším prostředím pro správnou funkci střeva. Porucha synchronizace těchto hodin, např. při směnném provozu nebo při častých přeletech přes časová pásma, by mohla souviset s rozvojem chorob gastrointestinálního traktu, včetně nádorového bujení v tlustém střevě.

Imunopozitivní buňky lokalizované selektivně v epitelu krypt. Intenzita PER1 a BMAL1 imunoreaktivity byla vyšší během dne než během noci

Sládek M., Rybová M., Jindráková Z., Zemanová Z., Polidarová L., Mrnka L., O‘Neil J., Pácha J., Sumová A.: Insight into circadian clock within the rat colonic epithelial cells. Gastroenterology 133: 1240-1249, 2007 (IF 12.457)

Kontaktní osoba: PharmDr. Alena Sumová, CSc., tel. 241062528, email: sumova@biomed.cas.cz

(Fyziologický ústav)
V uplynulém roce jsme zjistili, že modulace chování potkanů v úloze aktivního vyhýbání se místu pomocí ligandů D1 receptorů (D1 agonisty A77636 a D1 antagonisty SCH23390) je závislá na předchozí zkušenosti zvířete. Výsledky ukázaly, že modulační vliv těchto ligandů vymizí, pokud jsou zvířata přetrénována v úloze bez aplikace látek(Stuchlik, 2007). To naznačuje, že tyto látky ovlivňují neprostorové aspekty této úlohy. Pouze vyšší dávky D1 antagonisty způsobily rovněž narušení motorické aktivity, což je v souladu s výsledky předchozích studií. V další studii jsme se zaměřili na ovlivnění dopaminových D2 receptorů pomocí specifického agonisty quinpirolu a antagonisty sulpiridu. Testování takto ovlivněných potkanů v úloze aktivního vyhýbání se místu ukázalo, že manipulace D2 receptorů postihuje především motorickou aktivitu, a teprve ve vyšších dávkách může dojít i k poškození prostorového vyhýbavého chování v této úloze (Stuchlik et al., 2007a). To naznačuje, že dopaminové D2 receptory mohou hrát v této úloze roli především v regulaci motoriky. Následující studie zkoumala, jak se projeví antagonismus dopaminových D1 a D2 receptorů pomocí SCH23390 a sulpiridu na schopnosti potkanů učit se úlohu Morrisova vodního bludiště. Byly použity 2 verze této úlohy a to a) navigace k viditelné platformě (ukazující vliv látek na procedurální aspekt úlohy) a b) navigace k zanořené platformě (ukazující vliv na kognitivní funkce). Výsledky této práce ukázaly, že oba typy receptorů hrají rozdílnou roli v řešení úlohy vodního bludiště, a toto ovlivnění bylo rovněž rozdílné od ovlivnění úlohy aktivního vyhýbání se místu (Stuchlík et al., 2007b). To naznačuje, že výsledky získané v dané prostorové úloze je problematické generalizovat na úlohu jinou.

Obrázek znázorňuje laboratorního potkana kmene Long-Evans v experimentální aréně pro úlohu aktivního vyhýbání se místu. Zvíře se pohybuje po aréně s uniformním povrchem, a vyhýbá se neoznačenému sektoru, který je definován pouze jeho prostorovým umístěním vzhledem k orientačním bodům v místnosti (nejsou zachyceny)

Stuchlík A. Further study of the effects of dopaminergic D1 drugs on place avoidance behavior using pretraining: some negative evidence.. Behav. Brain Res. 178: 47-52, 2007 (IF 1,953)
Stuchlík A, Řeháková L, Rambousek L, Svoboda J, Valeš K.: Manipulation of D2 receptors with quinpirole and sulpiride affects locomotor activity before spatial behavior of rats in an active place avoidance task. Neurosci. Res. 58: 233-239, 2007a (IF 2,092)
Stuchlík A., Řeháková L., Telenský P., Valeš K.: Morris water maze learning in Long-Evans rats is differentially affected by blockade of D1-like and D2-like dopamine receptors. Neurosci. Lett., 422: 171-176, 2007b (IF 2,591)

Kontaktní osoba: RNDr. Aleš Stuchlík, PhD, e-mail: stuchlik @biomed.cas.cz

(Fyziologický ústav)
14-3-3 proteiny jsou regulační bílkoviny, které se hojně vyskytují ve všech eukaryotních buňkách. Jejich hlavní úlohou je regulace funkce celé řady jiných buněčných bílkovin. Díky velkému počtu vazebných partnerů se 14-3-3 proteiny účastní mnoha klíčových buněčných procesů. Mezi bílkoviny jejichž funkce jsou regulovány prostřednictvím vazby 14-3-3 proteinů patří i FOXO forkhead transkripční faktory. Tyto proteiny aktivují transkripci genů, které jsou důležité např. pro ochranu buněk před oxidativním stresem, kontrolu buněčného dělení, diferenciaci buněk, nebo řízenou buněčnou smrt (apoptosu). FOXO faktory jsou také řazeny mezi tzv. onkoproteiny, protože jejich dysfunkce se podílí na vzniku některých typů nádorů. Regulace FOXO je řízena proteinkinasou B, která je fosforyluje na třech místech. Díky fosforylaci dojde k navázání 14-3-3 proteinu a poté k rychlému transportu komplexu 14-3-3/FOXO z jádra buňky do cytoplasmy. Tím je funkce FOXO faktorů zcela zablokována. Molekulární mechanismus vlivu 14-3-3 proteinu na strukturu a funkci FOXO faktorů je však stále nejasný. Naše skupina nedávno ukázala, že vazba 14-3-3 proteinu ovlivňuje strukturu tzv. jaderné lokalizační sekvence FOXO faktorů v blízkosti DNA-vazebné domény (Obsilová a kol. (2005) Biochemistry 44, 11608-11617). Nyní jsme se zaměřili na studium mechanismu regulace DNA-vazebných vlastností FOXO faktorů. Naše výsledky ukázaly, že samotná fosforylace FOXO nemá významný vliv na vazbu DNA. Hlavním důvodem inhibice interakce FOXO s DNA je navázaní 14-3-3 proteinu na fosforylovaný FOXO faktor. Dále jsme ukázaly, že pro interakci FOXO faktoru s DNA jsou důležité oba konce DNA-vazebné domény. Tyto výsledky přispěly k lepšímu pochopení molekulárního mechanismu regulace FOXO transkripčních faktorů.

Tato struktura ukazuje, že N-koncový segment DNA-vazebné domény transkripčního faktoru FOXO4 se přímo účastní vazby DNA prostřednictvím aminokyselin R94, N95, W97 a Y102. Tato interakce zvyšuje stabilitu komplexu FOXO4-DNA.

Bouřa E., Šilhan J., Herman P., Večer J., Šulc M., Teisinger J., Obšilová V., Obšil T.: Both the N-terminal loop and wing W2 of the forkhead domain of transcription factor Foxo4 are important for DNA binding. J. Biol. Chem. 282: 8265-8275, 2007 (IF 5,808)

Kontaktní osoba: doc. RNDr. Tomáš Obšil, PhD., email: obsil@biomed.cas.cz

(Fyziologický ústav) Kapsaicin, výtažek z červených paprik, je v tradiční a současné medicíně užíván k léčení některých forem bolesti. Jeho lokální podání vyvolává u člověka palčivou bolest, která je paradoxně následována místním znecitlivěním. Mechanizmy těchto analgetických účinků nejsou dosud známy. Autoři charakterizovali molekulární mechanizmy aktivace a akutní desenzitizace (snížení citlivosti) vaniloidního (kapsaicinového) receptoru podtypu 1 TRPV1, který je fyziologicky lokalizován v plazmatické membráně periferních neuronů přenášejících informaci o bolestivém dráždění. Na základě studia vlivu experimentálně vnesených mutací aminokyselinových zbytků v předpokládané intracelulární oblasti póru TRPV1 iontového kanálu autoři zjistili, že tyto mutace vedou k výrazným změnám funkce receptoru: snižují teplotní práh pro jeho aktivaci a citlivost k chemickým, teplotním a napěťovým podnětům. Tato zcela nová informace o molekulární struktuře TRPV1 receptoru v jeho různých funkčních stavech pomohla identifikovat specifickou oblast proteinového komplexu, jejíž konformační změny se přímo podílejí na otvírání iontového kanálu. Autoři rovněž vyslovili hypotézu, že konformační změny, v jejichž důsledku dochází k akutní desenzitizaci TRPV1 receptoru závislé na vápníku, zahrnují oblast vazebného místa, v jehož blízkosti se nachází doména, která prostřednictvím kladně nabitého aminokyselinového zbytku zajišťuje interakci proteinu s fosfatidylinozitol-4,5-bisfosfátem, lipidem plazmatické membrány, který je v důsledku průniku vápníku do buňky hydrolyzován. Tyto nové poznatky přispívají k objasnění patogeneze některých bolestivých stavů a hledání účinnějších prostředků k jejich léčení.

Model aktivace a desenzitizace kapsaicinového receptoru (TRPV1): Na N-konci proteinu lokalizovaném na intracelulární straně TRPV1 receptoru existuje doména, která váže ATP a kalmodulin, jež Ca2+-závislým způsobem kompetují o vazebné místo. ATP a kalmodulin mají na TRPV1 kanál protichůdné účinky. ATP senzitizuje kanál, kdežto kalmodulin s navázaným Ca2+ jej tlumí (CLOSED). Kapsaicin se váže k TRPV1 receptoru na lipidovém rozhraní mezi S3 a S4 segmentem (OPEN). Krátký segment, který je lokalizován těsně vedle konzervovaného úseku tzv. TRP boxu (pravděpodobně v okolí argininového zbytku v poloze 701 a fosforylovatelného místa threoninu 704) splňuje předpoklad pro interakci s membránovým fofatidylinositol-4,5-bifosfátem (PIP2 ), který je zřejmě zodpovědný za zpomalení kinetiky otvírání kanálu v desenzitizovaném stavu (DESENZITIZED). Aktivace fosfatázy C (PLC) závisle na přítomnosti kalcia hydrolyzuje PIP2 což vede k inaktivaci iontového kanálu

Sušánková K., Ettrich R., Vyklický L., Teisinger J., Vlachová V.: Contribution of the putative inner-pore region to the gating of the transient receptor potential vanilloid subtype 1 channel (TRPV1). – J. Neurosci 27: 7578-7585 , 2007 (IF 7,453)
Nováková -Toušová K., Vyklický L., Sušánková K., Benedikt J., Samad A., Teisinger J., Vlachová V.: Functional changes in the vanilloid receptor subtype 1 channel during and after acute desensitization. - Neuroscience 149: 144-154, 2007 (IF 3,427)

Kontaktní osoba: RNDr. Viktorie Vlachová, DrSc. e-mail: vlachova@biomed.cas.cz

(Mikrobiologický ústav)
Mateřské mléko a kolostrum obsahuje nejen řadu živin, ale i imunologicky aktivních faktorů, které hrají velkou roli v rezistenci novorozence proti infekci a vývoji jeho imunitního systému. Snažili jsme se určit cytokinové spektrum mateřského mléka pomocí moderní multiplexové proteinové metody – protilátkového mikročipu. Množství jednotlivých cytokinů a jejich spektrum vykazovalo interindividuální variabilitu charakteristickou pro produkty sliznic a exokrinních žláz. Nalezli jsme 32 cytokinů, které v mateřském mléku dosud nikdo nepopsal. Některé z těchto cytokinů by se mohly podílet na vyzrávání střevního imunitního systému, (např. chemokiny PARC/CCL18, MIP-3alfa/CCL20, BLC/CXCL13), překvapující byl nález růstových faktorů, které ovlivňují vývoj nervového systému (např. brain-derived neurotrophic factor, Neurotrophin-3 a 4).

Kverka M., Burianová J., Lodinová-Žádníková R., Kocourková I., Cinová J., Tučková L., Tlaskalová-Hogenová H. Cytokine profiling in human colostrum and milk by protein array. – Clin. Chem. 53, 955-62, 2007

Kontaktní osoba: Miloslav Kverka, 29644 2452, kverka@biomed.cas.cz

(Mikrobiologický ústav)
V laboratoři byla dokončena charakterizace unikátních propeptidů plísňových hexosaminidas. Propeptidy nejsou v případě těchto enzymů degradovány, ale musí být odštěpeny v endoplasmatickém retikulu od svých mateřských molekul, aby mohly regulovat enzymatickou aktivaci, dimerizaci katalytických podjednotek a sekreci dimerního enzymu do extracelulárního prostředí. Tento mechanismus je aktivně využíván vláknitou houbou Aspergillus oryzae CCF1066 pro regulaci aktivity hexosaminidasy dle okamžité potřeby. Výsledky byly publikované ve dvou významných článcích, z nichž jeden získal ocenění jako „Hot Article“ od American Chemical Society (největší odborná profesní společnost na světě), druhý získal ocenění „Highly Accessed“.

Plíhal O., Sklenář J., Hofbauerová K., Novák P., Man P., Pompach P., Kavan D., Ryšlavá H., Weignerová L., Charvátová-Pišvejcová A., Křen V., Bezouška K.: Large propeptides of fungal β-N-acetylhexosaminidases are novel enzyme regulators that must be processed intracellularly to control activity, dimerization, and secretion into the extracellular environment. Biochemistry 46, 2719-2734, 2007, Ettrich R., Kopecký V. Jr., Hofbauerová K., Baumruk V., Novák P., Pompach P., Man P., Plíhal O., Kutý M., Kulik N., Sklenář J., Ryšlavá H., Křen V., Bezouška K. Structure of the dimeric N-glycosylated form of fungal beta-N-acetylhexosaminidase revealed by computer modeling, vibrational spectroscopy, and biochemical studies. – BMC Structural Biology 7, 32, 2007

Kontaktní osoba: Karel Bezouška, 29644 2142, bezouska@biomed.cas.cz

(Mikrobiologický ústav)
Bylo prokázáno, že v oxidativních enzymových mechanismech degradace dřeva houbou hnědé hniloby Gloeophyllum trabeum má významnou úlohu nový typ alkoholoxidasy sloužící jako hlavní extracelulární zdroj H₂O₂, komponenty Fentonova reagens pro produkci vysoce destruktivních hydroxylových radikálů. Narozdíl od dosud známé lokalizace v peroxisomech kvasinek je tento enzym sekretován do periplasmatického prostoru houbových hyf a imobilizován na extracelulárních membránových a polysacharidových strukturách. Za jeho odlišnou translokaci je zřejmě odpovědna unikátní C-terminální signální sekvence. Substrátem s nejvyšší k_cat/K_m je metanol, potenciálně dostupný z demetylace ligninové složky dřeva.

Daniel G., Volc J., Filonova L., Plíhal O., Kubátová E., Halada P. : Characteristics of alcohol oxidase from the fungus Gloeophyllum trabeum, an extracellular source of H2O2 in brown rot decay of wood. – Appl. Environ. Microbiol., 73 (19) 6241–6253, 2007

Kontaktní osoba: Jindřich Volc, 29644 2298, volc@biomed.cas.cz

(Ústav experimentální botaniky)
Rostlinný hormon auxin ovlivňuje zásadním způsobem široké spektrum vývojových procesů u rostlin. Mechanismus jeho účinku spočívající obecně v řízení specifické exprese genové informace byl v posledních letech detailně popsán. Oproti ostatním rostlinným hormonům se však auxin vyznačuje tím, že je v rostlině směrově dopravován z buňky do buňky prostřednictvím přenašečů umístěných v plazmatické membráně. Tato směrovost je klíčová při koordinaci vývojových procesů a v reakci rostliny na podněty z okolí jako jsou světlo či gravitace. Naše laboratoř přispěla významnou měrou k pochopení mechanismů aktivního transportu auxinu z buněk. S využitím systému buněk kultivovaných v suspenzních kulturách, adaptovaného pro přímá měření toku auxinu buňkami (4), jsme v první fázi popsali důležitost transportu auxinu z buněk při ustavení polarity buněčného dělení (1). Též jsme ukázali, jakým způsobem reagují struktury cytoskeletu a endomembrán na zastavení směrovaného transportu auxinu (2). Podíleli jsme se dále na objevení inhibičníhopůsobení auxinu na konstitutivní cyklování proteinů, včetně vlastních přenašečových proteinů rodiny PIN (3). Geny pro tyto přenašečové molekuly jsme následně transformovali do suspenzních kultur rostlinných buněk a stanovili řadu kinetických parametrů toku auxinu v těchto buněčných liniích ₍₅₎. Získané výsledky vedly k závěru, že proteiny PIN katalyzují přímo a specificky transport auxinu z buněk do mezibuněčných prostor. Současným předmětem studia naší laboratoře je především regulace aktivity proteinů PIN, která probíhá současně na více úrovních (6).

Pochopení role přenašečů auxinu z buněk:
Buňky tabáku, které se v suspenzní kultuře dělí a rostou v podobě řetízků (A) mají transportéry hormonu auxinu z buněk umístěny na příčných plazmatických přepážkách (B). Přílišná aktivita těchto transportérů způsobuje hladovění na auxin a buňky se prodlužují (C). Naopak zablokování aktivity transportérů auxinu z buněk způsobující hromadění hormonu uvnitř buněk velmi silně ovlivňuje polaritu řetízků (C)

1. Petrášek, J., Elčkner, M., Morris, DA., Zažímalová, E.: Auxin efflux carrier activity and auxin accumulation regulate cell division and polarity in tobacco cells. Planta 216, 302-308, 2002.
2. Petrášek, J., Černá, A., Schwarzerová, K., Elčkner, M., Morris, DA., Zažímalová, E.: Do Phytotropins Inhibit Auxin Efflux by Impairing Vesicle Traffic? Plant Physiology 131, 254-263, 2003.
3. Paciorek, T., Zažímalová, E., Ruthardt, N., Petrášek, J., Stierhof, YD., Kleine-Vehn, J., Morris, DA., Emans, N., Jürgens, G., Geldner, N., Friml, J.: Auxin inhibits endocytosis and promotes its own efflux from cells. Nature 435(7046): 1251-1256, 2005.
4. Petrášek, J., Zažímalová, E.: The BY-2 Cell Line as a Tool to Study Auxin Transport. In: Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol. 58 "Tobacco BY-2 Cells: From Cellular Dynamics to Omics", Nagata, T., Matsuoka, K., Inzé, D. (eds), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 107-115, 2006.
5. Petrášek, J., Mravec, J., Bouchard, R., Blakeslee, J., Abas, M., Seifertová, D., Wiśniewska, J., Tadele, Z., Čovanová, M., Dhonukshe, P., Skůpa, P., Benková, E., Perry, L., Křeček, P., Lee, OR., Fink, G., Geisler, M., Murphy, A., Luschnig, C., Zažímalová, E., Friml, J.: PIN proteins perform a rate-limiting function in cellular auxin efflux. Science 312: 914-918, 2006.
6. Zažímalová, E., Křeček, P., Skůpa, P., Hoyerová, K., Petrášek, J.: Polar transport of plant hormone auxin - the role of PIN-FORMED (PIN) proteins. Cellular and Molecular Life Sciences 64: 1621-1637, 2007.

Kontaktní osoba: Jan Petrášek, +420 225106453, petrasek@ueb.cas.cz

(Ústav experimentální botaniky)
Cytokininy jsou rostlinné hormony regulující buněčný cyklus a řadu dalších fyziologických procesů rostlin. Cytokininový signál je v Arabidopsis thaliana rozpoznáván třemi senzorovými histidinovými kinázami, CRE1/AHK4, AHK3 a AHK2. Připravili jsme jednoduché, dvojité a trojité mutanty těchto receptorů. Semana mutantů A. thaliana rychleji klíčila a byla méně citlivá na krátkovlnné červené světlo. Semena trojitého mutanta i jejich embrya byla více než dvojnásobně velká, naznačující význam cytokininů v regulaci vývoje semen. Výsledky rovněž negativně potvrdily regulační úlohu cytokininů ve vývoji kořene (4). CRE1/AHK4 a AHK3 jsou citlivější k bazím isoprenoidních než aromatických cytokininů (1). Na základě exogenně aplikovaných cytokininů v biotestech byly pyrrolo[2,3-d]pyrimidiny, pyrazolo[4,3-d]pyrimidiny a některé další strukturní deriváty označeny jako anticytokininy. Anticytokininy nesnižují vazbu značeného cytokininu na receptory, jejich aplikace vede k desorganizaci cytoskeletu a apoptóze. Zjistili jsme, že klasické anticytokininy inhibují rostlinné i živočišné cyklin-dependentní kinázy (CDK). Rentgeno-strukturní analýza co-krystalu lidské CDK2 s derivátem pyrazolo[4,3-d]pyrimidinu potvrdila, že tyto látky obsazují vazebné místo pro ATP. Testováním cytotoxicity anticytokininů na nádorových liniích jsme prokázali, že vykazují buněčnou účinnost srovnatelnou se známými inhibitory CDK (2). Vyvinuli jsme první anticytokinin kompetující s vazbou trans-zeatinu na CRE1/AHK4 a AHK3 (6) a připravili nové vysoce biologicky aktivní deriváty 6-benzylaminopurinu (5), které však nevykazují afinitu k CRE1/AHK4 a AHK3. Zřejmě existuje jiný, zatím neprobádaný systém přenosu signálů aromatických cytokininů v rostlinách (3). Anticytokininy vykazují i silnou antisenescenční aktivitu na lidských fibroblastech, a proto první z těchto derivátů byl nedávno úspěšně klinicky vyzkoušen v USA. Látky jsou chráněny několika mezinárodními patenty (6).

1. Spíchal, L., Rakova, N.Y., Fiedler, M., Mizuno, T., Romanov, G.A., Strnad, M., Schmülling, T.: Two Cytokinin Receptors of Arabidopsis thaliana, CRE1/AHK4 and AHK3, Differ in their Ligand Specificity in a Bacterial Assay. Plant Cell Physiol. 459:1299-305, 2004.
2. Spíchal L., Kryštof V., Paprskářová, M., Lenobel, R., Stýskala, J., Binarová, P., Fenolová, V., De Veylder, L., Inzé, D., Kontopidis G., Fischer, P.M., Schmülling, T., Strnad, M. Classical anticytokinins do not interact with cytokinin receptors, but inhibit cyclin-dependent kinases. J Biol Chem. 282: 14356-14363, 2007.
3. Doležal, K., Popa, I., Kryštof, V., Spichal, L., Fojtiková, M., Holub, J., Lenobel, R., Schmülling, T., Strnad, M.: Preparation and biological activity of 6-benzylaminopurine derivatives in plants and human cancer cells. Bioorg Med Chem. 14:875-884, 2006.
4. Fiedler, M., Novák, O., Strnad, M., Schmülling, T.: Arabidopsis Cytokinin Receptor Mutants Reveal Functions in Shoot Growth, Leaf Senescence, Seed Size, Germination, Root Development, and Cytokinin Metabolism. The Plant Cell 18:40-54, 2006.
5. Spíchal, L., Popa, I., Voller, J., Doležal, K., Werner, T., Schmülling, T., Strnad, M.: Substituované 6-(alkylbenzylamino)purinové deriváty pro použití jako antagonisté cytokininových receptorů a přípravky obsahující tyto sloučeniny. PV 2007-691
6. Doležal, K., Popa, I., Holub, J., Lenobel, R., Werbrouck, S., Strnad, M., Zatloukal, M.: Heterocyclic compound based on N6-substituted adenine, methods of their preparation, their use for preparation of drugs and pharmaceutical preparations containing these compounds. Applicant: ÚEB AV ČR, čísla patentů: SG102332, RU 2 302 421 C2, US 7279482 B2, NZ 538596, NZ 538597, ZA 2004/1461, CZ 294 535 B6.

Kontaktní osoba: Miroslav Strnad, +420 585634850, strnad@ueb.cas.cz

(Ústav experimentální medicíny)
Tato studie představuje výsledek prvního mezinárodního srovnání velkého počtu nezávislých linií lidských embryonálních kmenových (ES) buněk z laboratoří z celého světa (International Stem Cell Initiative), které bylo provedeno s cílem odhalit jejich společné a rozdílné znaky. Konkrétně jsme v rámci této studie analyzovali 59 linií lidských ES buněk, pocházejících ze 17 laboratoří v 11 zemích. Jako parametry biologického/molekulárního fenotypu jsme zvolili a testovali následující znaky: expresi 17 různých povrchových antigenů, expresi RNA pro 93 různých genů, expresi alel 10-ti různých genů podléhajících genomickému imprintingu, a diferenciační potenciál buněk určený schopností tvořit teratomy (benigní nádory) v experimentálních zvířatech. Mimo to jsme také testovali kvalitu jednotlivých linií z hlediska infekce vybranými bakteriemi, mykoplasmaty a viry. Z těchto analýz vyplynulo, že linie lidských ES buněk, přes svůj různý genetický základ a přes různé přístupy, které byly použity k jejich izolaci a kultivaci, vykazují výraznou podobnost v mnoha znacích nediferencovaných a diferencujících se lidských ES buněk. Nicméně, studované linie nebyly zcela identické. Nalezli jsem rozdíly v expresi molekulárních znaků typických pro diferenciační linie a také výraznou variabilitu v expresi alel imprintovaných genů. Významným poznatkem je také skutečnost, že ani u jedné z 59 linií lidských ES buněk jsme neodhalili mikrobiální kontaminaci. Mimo svoje vědecké přínosy, je tato studie jedním z významných kroků směrem k ustavení obecných standardů a procedur, které umožní verifikaci výsledků experimentů mezi laboratořemi po celém světě. Je také základem pro další mezinárodní kooperaci zaměřenou na vytvoření teoretických základů pro budoucí použití lidských ES buněk v regenerativní medicíně, vývoji léčiv a toxikologii.

Adewumi O, Aflatoonian B, Ahrlund-Richter L, Amit M, Andrews PW, Beighton G, Bello PA, Benvenisty N, Berry LS, Bevan S, Blum B, Brooking J, Chen KG, Choo AB, Churchill GA, Corbel M, Damjanov I, Draper JS, Dvorak P, Emanuelsson K, Fleck RA, Ford A, Gertow K, Gertsenstein M, Gokhale PJ, Hamilton RS, Hampl A, Healy LE, Hovatta O, Hyllner J, Imreh MP, Itskovitz-Eldor J, Jackson J, Johnson JL, Jones M, Kee K, King BL, Knowles BB, Lako M, Lebrin F, Mallon BS, Manning D, Mayshar Y, McKay RD, Michalska AE, Mikkola M, Mileikovsky M, Minger SL, Moore HD, Mummery CL, Nagy A, Nakatsuji N, O'Brien CM, Oh SK, Olsson C, Otonkoski T, Park KY, Passier R, Patel H, Patel M, Pedersen R, Pera MF, Piekarczyk MS, Pera RA, Reubinoff BE, Robins AJ, Rossant J, Rugg-Gunn P, Schulz TC, Semb H, Sherrer ES, Siemen H, Stacey GN, Stojkovic M, Suemori H, Szatkiewicz J, Turetsky T, Tuuri T, van den Brink S, Vintersten K, Vuoristo S, Ward D, Weaver TA, Young LA, Zhang W.: Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. - Nature Biotechnology 7:803-816 (2007), IF= 22,672

Kontaktní osoba: Doc. Aleš Hampl; 549493514; ahampl@med.muni.cz

(Ústav experimentální medicíny)
Jedná se o jednu z prvých studující, zabývajících se důsledky expozice polycyklickým aromatickým uhlovodíkům (PAU) v okolním ovzduší na nemocnost předškolních dětí, které jsou obzvláště vnímavé k chorobám způsobovaným znečištěním ovzduší. PAU se dostávají do ovzduší při spalování uhlí, z výfuků motorových vozidel, při topení dřevem v kamnech a krbech, z tabákového kouře, a při grilování. Ve studii jsme sledovali výskyt akutního zánětu průdušek (bronchitis) ve dvou okresech České republiky: Teplice, s vysokou úrovní znečištění, a Prachatice, s nižšími hladinami expozice. Monitorování koncentrace prachových částic < 2,5 μm (PM_2.5) a PAU bylo realizováno denně, popřípadě každý třetí den. Do studie bylo zahrnuto 1133 dětí, jejichž zdravotní stav byl sledován od narození do věku 3, popřípadě 4,5 roku, s použitím dokumentace ošetřujích dětských lékařů. Tyto děti byly součástí větší kohorty dětí (N = 7502), narozených v květnu 1994 až prosinci 1998, a sledovaných v předešlých studiích. Pro analýzu nemocnosti byly k dispozici údaje o porodní váze, kojení, vzdělání a věku matky, kouření rodičů, bytových poměrech, včetně paliva pro vytápění domu/bytu a vaření, atd. Po adjustaci pro roční období, teplotu a další kovariáty, stoupal výskyt akutní bronchitidy se stoupající koncentrací polutantů v ovzduší. V období od narození do věku dvou let při vzestupu průměrné měsiční koncentrace PAU o 100 ng/m³ a koncentrace PM_2.5 o 25 μg/ m³, byl poměr výskytu (rate ratio) bronchitidy pro PAU 1,29 (95 % CI, 1,07-1,54) a pro PM_2,5 1,30 (95% CI, 1,08-1,58). Ve věku 2 až 4,5 roku bylo rate ratio pro PAU 1,56 (95% CI, 1,22-2,00) a pro prachové částice 1,23 (95% CI, 0,94-1,62). Asociace byly silnější pro průměrné koncentrace polutantů za delší časové období, pro výskyt bronchitidy u starších dětí (> 2 roky), a pro hladiny PAU ve srovnání s koncentracemi prachových částic. Přednosti studie a intenzita asociací dovolily závěr, že relativně krátkodobé expozice běžně se vykytujícím PAU mohou pro malé děti představovat zvýšené riziko výskytu respiračních onemocnění.

Hertz-Picciotto I., Baker R.J., Yap P.S., Dostál M., Joad J.P., Lipsett M., Greenfield, T., Herr C.E., Beneš I., Shumway R.H., Pinkerton K.E., Šrám R.: Early Childhood Lower Respiratory Illness and Air Pollution. Environ. Health Perspect. 2007; 115:1510-1518, IF=5,861.

Kontaktní osoba: MUDr. R. Šrám, DrSc., 241062596, sram@biomed.cas.cz

(Ústav experimentální medicíny)
Membránový potenciál je považován zejména za hybnou sílu transportu iontů a metabolitů. Na modelu kvasinky Saccharomyces cerevisiae jsme ukázali novou roli membránového potenciálu v uspořádání plasmatické membrány. V kvasniční plasmatické membráně je možno rozlišit dva nepřekrývající se kompartmenty. První z nich má tvar nepravidelné sítě a je obsazen protonovou ATPasou Pma1. Druhý ve tvaru 300nm izolovaných ohnisek hostí protonové symportéry (Can1, Fur4, Tat2 a HUP1) a Sur7, složku nedávno popsaných eisosomů. Prokázali jsme, že steroly, hlavní lipidová složka plasmatické membrány, jsou rovněž akumulovány v těchto ohniscích. Naše výsledky svědčí o tom, že tato kompartmentace plasmatické membrány je výrazně ovlivněna energetickým stavem membrány. Membránová depolarizace způsobí reversibilní rozptýlení H+-symportérů, avšak nikoli Sur7 proteinu. V souhlase s těmito pozorováními se mění i fyzikální vlastnosti depolarizované membrány, např. její citlivost vůči detergentům.

Grossmann G, Opekarova M, Malinsky J, Weig-Meckl I, Tanner W. Membrane potential governs lateral segregation of plasma membrane proteins and lipids in yeast. - EMBO J 26:1-8 (2007), IF= 10,053

Kontaktní osoba: Jan Malinsky; 241062597; malinsky@biomed.cas.cz

(Ústav molekulární genetiky)
Neplodnost nositelů určitých chromozomálních přestaveb je u myší i u člověka spojena s nekompletním párováním aberantních chromozomů v meióze a jejich kolokalizací s XY tělískem v samčích pohlavních buňkách. S využitím technologie DNA čipů autoři nalezli útlum přepisu genů lokalizovaných v nespárovaných oblastech, zatímco na asociovaném X chromozomu objevili poruchu přirozené inaktivace genů. Aberantní párování chromozomů v meiotické profázi prokázali přítomností fosforylovaného yH2AX histonu a BRCA1 markeru na translokovaných chromozomech a asociovaném X chromozomu. Práce přinesla první molekulární důkaz pro hypotézu postulující meiotickou inaktivaci X chromozomu jako kontrolní mechanismus normálního párování homologních chromozomů.

Porucha aktivity genů v pohlavních buňkách neplodných samců: Celogenomová analýza genové exprese pomocí DNA čipů prokázala:
(A) Utlumení řady genů v oblasti translokačního zlomu (modrá vertikála) na chromosomu 17; (B) Poruchu inaktivace genů podél celého X chromosomu v pachytenních spermatocytech sterilních myší. Podle navržené hypotézy je porucha inaktivace X chromozomu důsledkem disregulací na chromosomu 17 a v příčinné souvislosti se samčí neplodností

Homolka, D., Ivanek, R., Capkova, J., Jansa, P., Forejt, J.: Chromosomal rearrangement interferes with X-chromosome inactivation. - Genome Res. 17: 1431-1437 (2007)

Kontaktní osoba: prof. Jiří Forejt, tel.: 241 062 257, e-mail: jforejt@img.cas.cz

(Ústav molekulární genetiky)Rodina ptačích sarkomových a leukózových retrovirů (ASLV), která se vyvinula ze společného předka, využívá k infekci hostitelské buňky několika typů specifických povrchových receptorů. Vzácně nacházené genetické defekty těchto receptorů podmiňují resistenci k příslušným virům. Panel inbredních drůbežích linií udržovaných na našem ústavu je unikátním materiálem pro studium genetiky interakcí mezi virem a hostitelskou buňkou a v minulosti byl využit pro identifikaci nového typu receptoru i několika receptorových mutant. Mutace, které ovlivňují infekci viru jen mírně, tj. navozují semiresistenci, nejlépe vypovídají o strukturních požadavcích vazby viru na receptor a následné fúze s membránou hostitelské buňky. V roce 2007 jsme identifikovali a funkčně popsali semiresistentní mutantní receptor pro ASLV, který obsahuje bodovou mutaci mimo vazebné místo pro retrovirus. Poloha mutace naznačuje, že pro účinnou vazbu a infekci buňky virem je důležitá nejenom přítomnost vazebného místa, ale též jeho vzdálenost od membrány a rigidita receptoru. Ačkoli neznáme přirozené ligandy receptorů pro ASLV, víme, že velmi podobnou molekulou je jeden typ lidského receptoru pro apoptogenní ligand TRAIL. Námi studovaný virový receptor tak naznačuje fungování tohoto faktoru, který je důležitý pro správný vývoj, imunitní reakce a vznik nádorů. ASLV sice nepředstavují zásadní nebezpečí pro komerční produkci drůbeže, jejich studium ale pomáhá v pochopení obecných zákonitostí vstupu viru do buňky a při vývoji nových strategií antiretrovirové ochrany člověka a hospodářských zvířat.

Schema doménové struktury sensitivního (TvbS1) a semiresistentního (TvbR2) receptoru. Mutace v semiresistentním receptoru mění strukturu domény CRD3 daleko od vazebného místa pro retrovirus.

Reinišová, M., Šenigl, F., Yin, X., Plachý, J., Geryk, J., Elleder, D., Svoboda, J., Federspiel, M.J., Hejnar, J: A Single Amino Acid Substitution in the TvbS1 Receptor Results in Decreased Susceptibility to Infection by Subgroups B and D, and Resistance to Infection by Subgroup E Avian Sarcoma and Leukosis Viruses In Vitro and In Vivo. - J Virol. [Epub ahead of print] Dec. 19

Kontaktní osoba: Dr. Jiří Hejnar, tel.: 296 443 443, e-mail: hejnar@img.cas.cz

(Ústav molekulární genetiky)
Multipotentní progenitorové buňky jsou nezralé buňky, které se podle okolností mohou vyvíjet v několik různých buněčných typů. Uplatňují se jak v časných fázích embryonálního vývoje - např. buňky neurální lišty, tak i v dospělosti - např. krvetvorné progenitory. Z buněk neurální lišty se vyvíjejí mimo jiné buňky periferního nervového systému nebo kožní pigmentové buňky. Z krvetvorných progenitorů se vyvíjejí všechny typy buněk tvořících krev. Určení konkrétního vývojového osudu progenitorové buňky je diktováno mnoha, často dosud neznámými, faktory. Rozhodující roli při tom hraje zapínání a vypínání specifických skupin genů v jádře progenitorové buňky, které je ovládáno specializovanými bílkovinami, tzv. transkripčními regulátory. Některé transkripční regulátory, jsou-li mutovány, mohou vnutit potomstvu progenitorových buněk nejen nevhodný osud, ale i nádorové vlastnosti.
Autoři článku zjistili, že transkripční regulátor Myb, který se podílí na určení vývojového osudu krvetvorných buněk, a jeho onkogenní mutanta v-Myb, která navíc vyvolává nádorovou transformaci jednoho typu krevních buněk - monocytů, mají obdobné aktivity i v buňkách neurální lišty. V těchto buňkách podporuje Myb vývoj na pigmentové buňky - melanocyty. Mutanta v-Myb vynucuje vývoj melanocytů, v nichž vyvolává některé nádorové vlastnosti.
Autoři usuzují, že zřejmě existují společná pravidla pro určování vývojového osudu různých progenitorů a snad i společné mutace, které vedou k nádorové transformaci některých buněčných typů v potomstvu progenitorových buněk. Paralelní sledování vývoje různých progenitorových buněk tak může usnadnit nalezení klíčových událostí jak při určování buněčného osudu, tak i počátků nádorové transformace.

Obrázek ukazuje normální melanocyty (A) a melanocyty transformované mutantou v-Myb (B). Černé body jsou zrnka melaninu

Karafiat, V., Dvorakova, M., Pajer, P., Cermak, V., Dvorak, M.: Melanocyte fate in neural crest is triggered by Myb proteins through activation of c-kit. - Cell. Mol. Life Sci. 64: 2975-2984 (2007)

Kontaktní osoba: Dr. Michal Dvořák, tel.: 241 063 390, e-mail: mdvorak@img.cas.cz

(Ústav živočišné fyziologie a genetiky)
Mechanizmy, které řídí sebeobnovu a diferenciaci kmenových buněk, jsou komplexní a nejsou dosud zcela známé. Porozumění neurogenezi a diferenciaci nervových buněk přinese obrovský pokrok v léčbě onemocnění nervového systému. Pro lepší pochopení molekulárních mechanizmů diferenciace nervových kmenových buněk autoři využili kombinace výhodného modelu in vitro diferenciace fetálních prasečích nervových kmenových buněk (NSCs) a proteomické analýzy. Pomocí dvojrozměrné gelové elektroforézy následované hmotnostní spektrometrií nejprve zmapovali proteiny konstitutivně přítomné v nervových kmenových buňkách a poté identifikovali proteiny, jejichž hladina se významně zvyšuje či snižuje během diferenciace nervových buněk. Mezi konstitutivně přítomnými proteiny byly nejčastěji identifikovány proteiny účastnící se metabolismu a úprav RNA a proteinů, včetně chaperonů, následované proteiny hrajícími roli v buněčné organizaci (cytoskeletární proteiny a anexiny). Diferenciace nervových buněk byla doprovázena změnami v hladinách DNA a RNA vazebných proteinů, proteinů upravujících a transportujících mRNA, a dále proteinů účastnících se odpovědi na stres, skladování železa a regulace redox potenciálu. Indukce α-B crystallinu a heterogenních jaderných ribonukleoproteinů (hnRNP) A1 a A2/B1 během diferenciace byla dále potvrzena imunoblotem. Navíc byla pomocí imunocytochemie pozorována specifická lokalizace α-B crystallinu v cytoplazmě a jádrech gliových buněk. Pomocí imunocytochemie byla potvrzena i zvyšující se exprese proteinů hnRNP A1 a hnRNP A2/B1 během diferenciace. Tyto výsledky představují významný krok k pochopení procesu diferenciace nervových buněk a proteinů souvisejících s tímto procesem. Ionizace elektrosprejem vodného roztoku dusičnanu stříbrného vede k vytvoření tříatomového kationu Ag₂O⁺ v plynné fázi. Reakce hmotnostně vybraného kationtu Ag₂O⁺ s etylénem při pokojové teplotě poskytuje etylénoxid. Transformace etylénu na etylénoxid pomocí katalyzátoru založeném na stříbře je důležitý technický proces prováděný ve velkém měřítku a na plynný kation Ag₂O⁺ můžeme nahlížet jako na nejmenší model pro účinný katalyzátor. Experimentální poznatky jsou plně podpořeny výsledky kvantově-chemického studia, které naznačují, že rychlost-určující krok, jak pro epoxidaci, tak pro přesmyk na acetaldehyd, který vede k úplné oxidaci (nežádoucí proces), odpovídá vytvoření metallaoxetanu.

Diferenciace nervových kmenových buněk:
Prasečí nervové kmenové buňky, diferencující v neurony (zeleně) a astroglie (červeně). Jádra všech buněk označena modře. Nediferencované kmenové buňky v pravém dolním rohu

Skalníková, H., Halada, P., Vodička, P., Motlík, J., Řehulka, P., Horning, O., Chmelík, J., Norregaard-Jensen, O., Kovářová, H.: A proteomic approach to studying the differentiation of neural stem cells. - Proteomics. 7:1825-1838 (2007)

Kontaktní osoba: RNDr.Hana Kovářová, CSc., tel.: 315 639 582, kovarova@iapg.cas.cz

(Ústav živočišné fyziologie a genetiky)
Poruchy separace kůstek středního ucha a vytváření incudo-maleálního kloubu mohou vést až ke ztrátě sluchu a jsou spojeny s některými syndromy (např. Branchio-Oto-Renal, Treacher Collins). Funkční studie ve spolupráci s CFD London a s využitím explantátových kultur prokázala uplatnění transdiferenciace v separaci středoušních kůstek

Funkční studie downregulace v inkudomaleální oblasti

Amin, S.A., Matalová, E., Simpson, C., Yoshida, H., Tucker, A.S.: Incudomalleal joint formation: the roles of apoptosis, migration and downregulation. - BMC Dev Biol 7: 134 – 141 (2007)

Kontaktní osoba: RNDr. Eva Matalová, PhD., tel.: 532 290 155, matalova@iach.cz

(Ústav živočišné fyziologie a genetiky)
Poprvé byly prezentovány výsledky rozsáhlého studia introgrese jak autozomálních, tak i pohlavně vázaných znaků přes hybridní zónu mezi dvěma poddruhy domácích myší, Mus musculus musculus a M. m. domesticus. Tato práce je založena na analýze sady alozymových lokusů (představujících neutrální nebo přibližně neutrální markery) a lokusů vázaných na chromozom X (o kterých se předpokládá, že na ně působí selekce) u velkého souboru více než 1800 jedinců odchycených na 105 lokalitách v Z Čechách a SV Bavorsku. Bylo prokázáno, že přechod alozymů přes zónu je pozvolnější než u znaků na X. Srovnání výsledků ze střední Evropy a Dánska (kde je zóna mnohem mladší) ukázalo, že šířka zóny se s časem nemění. Na základě zjištěných dat byly odhadnuty hodnoty některých důležitých evolučních parametrů, např. bariéry toku genů, disperze, selekce nebo fitness hybridních jedinců. Ukázalo se, že selekce v myší hybridní zóně ovlivňuje řádově desítky lokusů. Dále bylo ukázáno, že ke spolehlivějším závěrům o částech genomu, účastnících se reprodukční bariéry, je nutno srovnat výsledky z více transektů, analyzovaných ve dvourozměrném prostoru a to pomocí rigorózních statistických metod včetně inspekce věrohodnostních profilů.

Genetická analýza autosomálních a na X chromozóm vázaných znaků v hybridní zóně domácích myší

Macholán, M., Munclinger, P., Šugerková, M., Dufková, P., Bímová, B., Božíková, E., Zima, J., Piálek, J.: Genetic analysis of autosomal and x-linked markers across a mouse hybrid zone. - Evolution, 61: 746-771 (2007)

Kontaktní osoba: prof. RNDr. Miloš Macholán, CSc., tel. 532 290 138, macholan@iach.cz